柠条酶解糖化的预处理方法

柠条酶解糖化的预处理方法柠条酶解糖化的预处理方法 2015/04/23 1材料与方法1.1试验材料(1)原料原料来自于宁夏固原的5年生柠条的平茬废弃物，经自然晒干、粉碎后过10目与20目标准筛，选择粒径介于0.852mm之间的粉末作为实验材料。(2)菌种微生物菌种选用模式菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，购于美国标准生物品收藏中心(ATCC)，属丝状白腐真菌。(3)纤维素酶纤维素酶(固体)由宁夏夏盛实业集团有限公司惠赠，经测定其总纤维素酶活性(以滤纸为底物测定，pH4.8)约为64FPU/g。(4)培养基PDA培养基。柠条培养基按柠条自来水为11.5(质量/体积比，m/v)的比例向柠条中加入自来水搅拌均匀制成，于121灭菌30min。1.2试验方法(1)碱处理碱处理采用0.1%5%的NaOH溶液以120固液比在100下处理15min，用蒸馏水对照。处理后用200目滤布过滤，收集滤液用H2SO4调节pH值至中性并测定滤液中还原糖含量，滤渣用自来水冲洗至中性后烘至恒重。(2)酸处理酸处理采用0.025%1%的硫酸以120固液比在120下处理1h，用蒸馏水做对照。处理后用200目滤布过滤，收集滤液用NaOH调节pH至中性并测定滤液中还原糖含量，滤渣用自来水冲洗至中性后烘至恒重。(3)微生物处理将菌种接种至PDA培养基上于28活化57天，活化后采用固体接种的方法挑取直径为23mm的菌苔接种到柠条培养基上，每瓶接10块。接种后置于28培养，分别在第36周取样，于105干燥4h。(4)酶解糖化采用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8)于50溶解固体纤维素酶，酶浓度为1.25g/mL。称取0.160g预处理前后的样品，按每克生物质20FPU加入纤维素酶酶液，并用于pH值为4.8的醋酸醋酸钠缓冲液补充至反应体系总体积为8mL，于48静置酶解48h后用定性滤纸过滤，弃滤渣，采用DNS法13测定滤液中还原糖含量。(5)木质纤维素含量测定参照NEL的方法14测定纤维素、酸不溶木质素(AIL)、酸溶性木质素(L)和木质素(AIL+L)含量，半纤维素含量采用中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维法15测定。(6)转化率与总还原糖得率的计算滤渣酶解糖化情况用转化率表示，以酶解转化出的还原糖质量占酶解前生物质质量百分比表示，转化率/%=酶解转化的还原糖质量酶解前称取的样品质量100%总还原糖包含酸/碱水解出的还原糖及酶解产糖，以酸/碱水解产生的还原糖与酶解转化产生的还原糖质量之和占酶解前生物质质量百分比表示，总还原糖利率/%=(酸/碱水解产生的还原糖质量+酶解转化的还原糖质量)酶解前称取的样品质量100%1.3数据的统计分析方法采用Excel和SPSS19.0统计软件对实验数据进行分析，结果以平均值标准误差(MSE)表示，对不同预处理的结果进行统计学Duncan检验比较差异，不同处理间的差异(p0.05)以小写字母表示。2结果与分析2.1不同预处理后样品质量损失和酶解转化效率变化预处理是生物质转化利用的必要手段，其主要目的是通过预处理破坏木质纤维素的复杂结构，降低纤维素结晶度，提高纤维素酶的效率16。预处理过程中，不同方式对酶的催化作用有着不同的效果，酶解转化效率能有效表征不同样品对纤维素酶的敏感程度。转化率反映了单位质量生物质酶解释放可发酵糖的能力，因此以转化率表示不同预处理方法对生物质的改性程度。为了评价3种预处理方法对柠条酶解效果的差异，比较了预处理前后柠条的转化率变化情况，同时考查了预处理对样品重量的影响，结果见图13。经不同浓度稀H2SO4处理的样品失重率与酶解转化率如图1所示。由图1可以看出，稀硫酸处理导致柠条重量损失显著，样品失重率随稀H2SO4浓度增加呈上升趋势，硫酸处理后固体残渣的酶解转化率与硫酸浓度无显著相关性。稀硫酸能够有效去除木质纤维素中的半纤维素成分，因此0.1%H2SO4处理即可引起柠条失重率达15.1%，处理程度增加也会导致部分纤维素组分的水解，1%硫酸处理时失重率达到40.8%。从酶解转化率来看，一定浓度的稀硫酸预处理虽然能够促进柠条酶解糖化，但对柠条酶解效率的提高幅度不大，小于0.5%的硫酸处理时，酶解效率随硫酸浓度增加而升高;经0.5%H2SO4处理后的固体残渣酶解效率提高最显著，酶解转化率比对照提高了20.3%;但随着硫酸浓度进一步提高，半纤维素被消化的越多，固体残渣中木质素含量相对升高，不利于酶解，酶解效率反而降低。因此，0.5%H2SO4是柠条酸法预处理的适宜浓度。经不同浓度NaOH处理的样品失重率与酶解转化率变化如图2所示。从失重率的变化可以看出，随着NaOH浓度的升高柠条失重率逐渐升高，当NaOH浓度提高至2.5%时，继续提高NaOH处理的浓度，柠条的失重率基本维持不变。转化率随NaOH处理浓度的变化显示，碱处理能够显著提高柠条酶解转化率，转化率随碱用量增加而持续升高，5%NaOH处理后的柠条酶解转化率最高，比未经处理的原材料提高了147.3%，达13.6%。经黄孢原毛平革菌处理不同时间的样品失重率与酶解后还原糖转化率如图3所示。由图3可知，白腐真菌处理后柠条平茬废弃物的失重率持续升高，最高为处理6周的样品，失重率达42.4%;酶解转化率也均显著高于对照，最高的是处理6周的样品，比未经处理的原料提高了48.6%，其次是处理3周的样品提高了38.1%。因此，白腐真菌处理6周是柠条平茬废弃物微生物法预处理的适宜时间。综合比较图13可以发现，从处理后固体残渣的酶解转化效率来看，三种预处理方法对酶解效率的影响程度顺序是:碱白腐真菌酸;其中，5%NaOH处理后样品的转化率最高，达13.6%，比原材料提高了147.3%。2.2预处理前后柠条的木质纤维素含量为探究各样品酶解转化率提高的关键因素，进一步测定了原料和经不同预处理后样品的木质纤维素成分，各组成分含量见图4。从图4可以看出，柠条平茬废弃物的半纤维素、纤维素和木质素等3种主要成分占90%以上，近似于木材，其中半纤维素含量最高达34.1%，其次是木质素32.7%。柠条中的可转化底物(纤维素与半纤维素)含量略高于玉米(Zeamayz)秸秆17，具有潜在的能源化利用价值。柠条为多年生灌木树种，其木质素含量远高于1年生的玉米秸秆，也高于多年生常绿树种毛竹(Phyllostachysheterocyclacv.pubescens)18，不利于可转化底物的释放和利用，这是柠条作为饲料的利用率低下的关键原因。柠条的高木质素含量可能与柠条生长在干旱半干旱的环境有关，研究表明干旱胁迫时植物可以通过提高木质素含量来减少水分损失，抵御干旱带来的不利影响。2#和3#为硫酸处理后的样品，硫酸处理后柠条中的纤维素和木质素含量升高，而且随着处理强度增加，硫酸对纤维素的水解程度增加，半纤维素含量显著降低，其中样品3#的半纤维素含量最低，为2.4%，比对照降低了93.0%，说明0.5%硫酸处理已经基本完全除去了柠条中的半纤维素，进一步增加硫酸浓度对预处理效果影响不大。4#6#为碱处理的样品，经碱处理后，柠条中纤维素含量显著升高，酸不溶性木质素AIL含量显著降低，其中，样品6#的纤维素含量最高，达50.2%，AIL木质素含量最低，为21.0%，说明2.5%NaOH处理能够有效去除柠条中木质素，导致纤维素含量相对增加。经白腐真菌处理后，纤维素和半纤维素含量均降低，说明白腐真菌降解柠条中的纤维素与半纤维素来获得营养物质;L含量显著高于所有处理后样品及原料，说明白腐真菌能使柠条木质素显著改性，该过程主要是以微生物胞外酶为主导的酶促反应，条件温和，速度缓慢。不同预处理后柠条中的半纤维素含量均显著降低，L含量均有所增加，说明柠条中的半纤维素比较容易被破坏，不同预处理均能改性木质素。结合不同预处理后酶解转化率和主要成分的变化情况可以发现，预处理后木质素的脱除与改性是提高柠条酶解效率的关键因素。2.3不同预处理样品的总还原糖得率除酶解转化率外，样品的质量损失在预处理方法评价中也是需要考虑的重要因素，因为几乎所有的木质纤维素预处理方法都无法避免样品质量损失，造成可转化底物的流失。总还原糖得率以预处理前生物质质量为基础，综合考虑预处理后从液体部分和固体部分酶解所获取的总还原糖量。总还原糖得率的计算过程引入了预处理引起的质量损失，能够从可转化物质产出的角度综合评价不同预处理方法。稀硫酸处理样品后，半纤维素(主要多糖是木聚糖)被水解生成单糖和可溶性低聚糖20，因此水解液中会含有木糖等还原糖，经稀H2SO4处理后总还原糖得率需要同时考虑水解液中糖得率和滤渣经酶解后糖得率。收集水解液用DNS法测其中还原糖含量并根据处理前样品质量计算水解液中还原糖得率，结果见图5(A)。由图5(A)可知，稀硫酸处理水解液中还原糖得率也随H2SO4浓度增大而增加。H2SO4浓度从0.1%增加到0.5%时，水解液中还原糖得率增加显著;当H2SO4浓度达到0.5%以后，继续增加其浓度，水解液中还原糖得率提高不大。结果表明，当H2SO4浓度达到0.5%时，增大其浓度样品中基本无还原糖继续释放，可能是因为在此处理浓度下半纤维素已经基本水解完全，继续增加处理强度只能引起部分纤维素非结晶区的水解。合并H2SO4处理后水解液中还原糖得率和滤渣经酶解后的还原糖得率，即为不同浓度稀H2SO4处理后的总还原糖得率，结果见图5(B)。由图5(B)可知，当H2SO4浓度在00.5%之间时，增加其浓度，所对应的总还原糖得率也随之增大而且增加速度较快;当H2SO4浓度大于0.5%时，继续增加H2SO4浓度，总还原糖得率变化不显著。H2SO4浓度为0.5%时总还原糖得率最高，为17.9%，是未处理原料的3.3倍。经NaOH处理后，滤液中主要为木质素水解的产物，经测定其中基本不含有糖类物质，因此，碱处理样品的总还原糖全部来源于处理后滤渣用纤维素酶水解产生的糖，总还原糖得率见图6。由图6可知，0.5%5.0%NaOH处理能有效提高柠条的总还原糖得率，浓度为0.5%和1%NaOH处理后样品的总还原糖得率最高，达8.5%，比对照提高了55.6%;其次是经浓度为5%和2.5%NaOH处理后的样品。白腐菌处理后样品总还原糖得率变化情况见图7。由图7可以看出，白腐菌处理3周的样品总还原糖得率最高，为5.8%，但与对照相比没有显著性差异;延长生物处理时间到46周后，总还原糖得率降低且显著低于未经处理的对照样品。这可能是由于白腐菌在破坏生物质结构的过程中，通过分泌胞外纤维素酶水解其中的纤维素，获得葡萄糖作为碳源和能源，导致处理后样品的可水解底物减少，致使总还原糖得率不断降低。综合分析比较图57可知，3种预处理方法对于柠条平茬废弃物总还原糖得率的影响程度排序是，酸碱白腐真菌;其中，0.5%H2SO4处理后总还原糖得率最高，可达17.9%，比未处理原料提高2.3倍。3结语柠条是适宜于北方和西北干旱半干旱地区培育的灌木树种2，富含纤维素和半纤维素，具有较高的饲用价值，亦可作为干旱地区的特色能源原料。但是，柠条中木质素含量高，对外界因素的抗逆性强，不利于可转化底物的释放和充分利用，需要寻求有效的方式进行预处理以提高柠条的利用率，拓展其应用范围。本项研究表明，稀硫酸处理后柠条的总还原糖得率是原料的3.3倍，预处理效果最好，显著高于碱法和微生物法。硫酸处理后水解液中释放出大部分的半纤维素来源的糖，固体残渣的酶解效率亦有所提高，酶解后残渣主要为木质素，热值高，可作燃料，也可开发出其它高附加值产品。此外，测试表明柠条偏酸性，有利于酸处理过程中减少酸用量，但碱处理时用碱量大。因此，从可转化底物的获取来看，稀硫酸处理是柠条平茬废弃物最佳的预处理方式。本研究从能源底物释放方面比较了几种预处理方式并获得了最适宜的方法为稀硫酸预处理，但尚未涉及其工艺条件的优化，后续稀硫酸预处理的工艺优化及复合预处理方式促进柠条能源化利用的研究正在进行。在饲料领域，消化率低下是导致柠条作为饲料利用量小的直接原因6，碱处理和白腐真菌预处理均能有效提高柠条的酶解效率，因此可以考虑在柠条贮存过程中引入微生物和碱来提高柠条的利用效率。采用微生物处理通过菌种酶系的作用降解与改性柠条中木质纤维素成分，结合碱法处理能够有效地脱除柠条中的木质素，不但能够提高柠条在动物体内的消化率，而且有利于改善柠条的适口性，增加其营养价值。作者：徐春燕姚福军张娜单位：宁夏大学生命科学学院西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室 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