人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准：重庆狂犬抗体检测指南

泓域健康/重庆狂犬抗体检测人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准一、 人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准狂犬病病毒RNA编码核蛋白（N）、M1、M2、病毒包膜糖蛋白（G）和L五种蛋白，其中G蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性T细胞和细胞毒性T细胞（CTL）增生，并诱导机体产生特异性抗体。G蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体，免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。N蛋白也是一种有效的保护性抗原，能够刺激B细胞和Th细胞诱导产生细胞和体液免疫。磷蛋白（P）可诱导CTL，但保护作用较弱。机体在接种狂犬病疫苗约7天左右产生IgM抗体，在约14天后产生IgG抗体并迅速升高。IgM和IgG抗体均具有中和病毒的能力，有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。CTL的高峰出现在免疫后12天，可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒，Th细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体，也能增加保护效果。但Suss的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明。由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守，氨基酸同源性达78%至93%，故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。狂犬病病毒的主要抗原部位为G蛋白外功能区，当其氨基酸同源性74%时，病毒之间能够交叉中和，为同一遗传谱系内的病毒；膜外区的氨基酸同源性62%时，则无交叉中和反应。目前疫苗株均属于遗传谱系I，对遗传谱系II中的病毒感染不具保护作用。现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。目前为止，遗传谱系I的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别，也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。故现有疫苗可能无法为遗传谱系I外的其他血清型病毒感染提供保护。因此，用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒，并具有稳定生物学特性的固定毒株，其历史和来源应确证清楚，并经过全面的特征性检定，符合国家相关文件的要求。病毒灭活后制成的疫苗对人体安全且能产生有效的免疫保护作用。WHO推荐用于疫苗生产的病毒固定毒株包括PasteurVirus、Pitman-Moore、Vnukovo-32、Flury鸡胚细胞低传代株和CTN株等。人用狂犬病疫苗应符合WHO生物制品标准专家委员会（ECBS）制定的指导原则中对疫苗特性、生产及质量控制的要求。用于制备疫苗的细胞基质应来源于健康动物，动物来源品系清楚。根据现行中国药典的要求，动物必须是清洁级或以上的动物。所用动物应符合实验动物微生物学和寄生虫学检测要求的相关规定。人二倍体及传代细胞应在限定代次内使用。病毒在细胞（或胚蛋）中增殖后，将收获的病毒进行浓缩、纯化、灭活，加入保护剂冻干而成。细胞培养疫苗的最低效价为在效期内每一剂肌注剂量达25IU以上，由NIH法检测确定。ELISA法检测糖蛋白等其他体外测定方法目前仍处于实验室验证阶段，但该方法已用于生产过程中抗原含量的控制。疫苗需经临床前研究及临床试验，企业需获得国家食品药品监督管理总局批准的生产许可证方可生产疫苗。WHO建议对新申请注册的疫苗，在临床试验中检测0、14、28/30、180、360天血清中和抗体水平。已经获准生产的人用狂犬病疫苗需按照国家食品药品监督管理总局的要求申请批签发，仅有获得批签发合格证的狂犬病疫苗批次方可上市使用。二、 冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）批签发量较多按照培养基质分品种进行统计，目前Vero细胞狂犬病疫苗是主流产品。冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）的批签发量为620129万支，市占率为7527%;人用狂犬病疫苗（Vero细胞）的批签发量为110318万支，市占率为1339%;地鼠肾细胞狂犬病疫苗的批签发量为53457万支，市占率为649%;最后是人二倍体细胞狂犬病疫苗的批签发量为39931万支，市占率为485%。由此来看，二代狂犬病疫苗（Vero细胞基质）仍然占据主导地位，三代狂犬病疫苗（人二倍体细胞基质）正在逐步崛起。三、 常用细胞培养狂犬病疫苗比较我国已上市的狂犬疫苗产品根据使用细胞基质不同可分为：二倍体细胞、Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）、地鼠肾细胞及鸡胚细胞，其中Vero细胞是目前应用最为广泛的动物细胞基质，Vero细胞更容易生产和储存，狂犬病毒表达滴度高，因此，Vero细胞狂犬疫苗具有生产控制水平高、产量大、生产成本较低的优势。但Vero细胞属于传代细胞，高浓度的Vero细胞DNA存在致肿瘤风险。此外，市场上的Vero细胞狂犬病疫苗均使用动物来源的血清和胰酶，产品存在外源病毒因子污染风险。人二倍体细胞疫苗是第三代狂犬病疫苗，与动物细胞相比，人二倍体细胞狂犬病疫苗具备天然的安全性优势，无致肿瘤风险，杂质去除要求低，被世界卫生组织称为预防狂犬病的黄金标准疫苗，是目前国内传统狂犬病疫苗的有力补充，尤其适用于过敏体质者、老人及儿童等免疫力偏低的人群。但人二倍体细胞存在培养难度高，狂犬病毒表达滴度低等问题，因此人二倍体细胞狂犬病疫苗产量较低、生产成本高。目前，我国获批签发上市的人用狂犬病疫苗企业共有8家。2018-2020年，我国利用Vero细胞基质培养的人用狂犬疫苗批签发数量占比最大，保持在90%左右；人二倍体细胞狂犬疫苗整体呈现出逐年上升的趋势。四、 狂犬病疫苗批签发量呈现平稳波动的态势由于狂犬病患病高死亡率，狂犬病疫苗使用接种尤为刚性，人用狂犬病疫苗是我国常年批签发量较大的疫苗品种之一。近年来，国内狂犬疫苗每年的批签发总量维持在6000-8000万支，即1200-1600万人份（4-5针/人份），2020年我国全年批签发各类狂犬疫苗大约8238万剂，较2019年同期增长4004%。2021年第一季度，狂犬病疫苗批签发量为1439万支，同比增长3019%。五、 当前狂犬疫苗发展面临的问题与困境疫苗的质量直接关系到国家公共卫生健康与安全，下一代人类疫苗通常是为了减少不良事件或提高现有疫苗的功效而开发的。目前上市的几款狂犬疫苗在预防狂犬病方面已经取得了巨大的成功，但仍然存在一定的局限性，因此仍然需要利用现代生物技术进一步改进完善。疫苗本身开发模式具有特殊性：研发即生产。车间产能的持续迭代背后存在大量时间成本、审批成本，产量决定了临床规模及商业化规模。血清问题：无血清培养是狂犬疫苗研制中世界性的技术难题，疫苗生产均使用动物来源的牛血清和猪胰酶，产品存在外源病毒因子污染风险，给后续产品生产带来挑战。降血清至无血清是国内疫苗生产企业共同的研究趋势。二倍体狂犬疫苗安全性强，为狂犬疫苗未来主要发展趋势之一。但存在成本高、制备困难、产量低、大规模培养难度较大等技术问题。免疫程序的选择：世卫组织已经批准了不同的方案，例如两点皮内注射（0，3和7天）；单点肌肉注射（0，3，7天和第14-28天之间）和3周肌肉注射（0天x2，7天x1和21天x1）疫苗接种。目前国内狂犬病疫苗接种程序所采用的是肌内接种，即五针法（0，3，7，14，28天）和2-1-1法（0天x2，7天x1和21天x1）。选择最佳的免疫接种程序可有效降低成本和剂量。中国的犬数超过1亿只，其中大部分在农村散养。消除狂犬病必须免疫动物，而与欧洲等发达国家的动物普遍免疫不同，中国接种疫苗的动物比例较少。因此，人用狂犬病疫苗属于刚性需求。随着人均可支配收入的增加，国内民众将愈发重视对疾病的预防和管理。随着中国人均可支配收入快速增长，人们付费接种疫苗的意愿和能力也将随之提高。此外，教育程度的提升会提高狂犬病疫苗接种率，这将促进人用狂犬病疫苗的销量增长。未来随着国内企业在疫苗领域研发投入的加大，优质的技术+充足的产能，将助力患者的可及性持续提升，推动狂犬疫苗长期可持续发展。狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患传染病。几乎所有温血动物都对狂犬病毒易感，其中犬类是主要宿主。狂犬病主要通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病毒经破损皮肤侵入体内传播。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病死亡率接近100%，即使治愈也会留下严重后遗症。目前对狂犬病缺乏有效的治疗手段，因此使用狂犬疫苗预防是关键。随着我国狂犬病预防的加强，发病人数及病死人数逐年下降。从发病病例来看，自2007年起，我国狂犬病发病病例逐步下降，目前，据国家卫健委数据，2021年我国狂犬病发病病例降至157例。六、 人用+宠物用双管齐下，助力狂犬病防控我国对狂犬病的防控，至今已有30年。2014年，康华生物的人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV）获批上市，开启了我国国产狂犬病疫苗的人源新时代。HDCV在免疫效果和起效速度方面优势明显，免疫持续时间可达10年，不良反应发生率低于1%，适用全人群（包括儿童、老人及孕妇），被视为预防人类狂犬病的金标准疫苗。此次启动的中国宠物狂犬病疫苗现状调研项目将覆盖宠物医院、宠物美容店，通过调查每年接种疫苗的犬、猫数量，以及宠物主人对于为犬和猫接种疫苗的认知和行为习惯，以期为狂犬病控制和预防提供新的思路和策略参考，促进行业发展。据透露，未来还将推出新一代、高标准、引用人用狂犬病疫苗生产技术的宠物狂犬病灭活疫苗，配合人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV），从人用和宠物用两个方向加强狂犬病的防控。在中国，狂犬病（Rabies）是一个重大的公共卫生问题，20152018年更是导致每年几百人死亡，超过95%的人类狂犬病病例来源于患狂犬病的狗。虽然狂犬病是一种严重的人兽共患病，但狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）在我国现行动物库内的循环和分布并不清楚。七、 国内狂犬疫苗市场持续增长近年来，随着我国狂犬病预防教育普及、人用狂犬病疫苗接种数量增加，我国狂犬病预防工作取得了重大进展，在控制狂犬病发病率方面起到了重要作用。2018年，中国人用狂犬疫苗市场规模达到284亿元，预计2022年将达到387亿元的市场规模。Vero细胞人用狂犬病疫苗是狂犬病疫苗市场的主导者，占据750%的市场份额；人二倍体细胞培养狂犬病疫苗和原代细胞培养狂犬病疫苗（包括地鼠肾细胞人用狂犬病疫苗和鸡胚细胞人用狂犬病疫苗）分别占据182%和68%的市场份额。中国疾病预防控制中心报告显示，我国狂犬病疫情主要分布在人口稠密的华中、华南、西南、华东地区。人群分布上呈三多特征：农村地区病例较多、15岁以下儿童和50岁以上人群发病较多。中国的犬数超过1亿只，其中大部分在农村散养。消除狂犬病必须免疫动物，而与欧洲等发达国家的动物普遍免疫不同，中国接种疫苗的动物比例较少。因此，人用狂犬病疫苗属于刚性需求。随着人均可支配收入的增加，国内民众将愈发重视对疾病的预防和管理。随着中国人均可支配收入快速增长，人们付费接种疫苗的意愿和能力也将随之提高。此外，教育程度的提升会提高狂犬病疫苗接种率，这将促进人用狂犬病疫苗的销量增长。