不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞

不同相对分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯内皮细胞岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan)是一种水溶性硫酸 杂聚糖,是褐藻特有的一种化学组分。据初步的药理 研究发现18 ,它具备抗凝血、抗肿瘤、抗HIV、抗血栓、提高免疫力、降血脂等多种医学功效,是当今天然 海洋药物研究的重点之一。血栓形成的最主要因素 是血管受到损伤,其中首当其冲的就是血管内皮细胞的损伤5。因此,判断一种药物是否可作为理想的抗 血栓药物,也应该对其是否具有保护血管内皮细胞的 功能进行考察。有报道称,海带中提取的高分子杂多 糖对血管内皮细胞可能具有保护作用6,在作者的前 期研究中,发现中、低相对分子质量的海带岩藻聚糖 硫酸酯均具有良好的抗血栓作用&。而其是否对内 皮细胞具有保护作用，尚待进一步研究。本实验同时 采用体内研究和体外研究的方法,考察不同相对分子 质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞的保护作用，并 探讨其作用机制,为开发抗血栓新药提供理论支持。1材料1.1动物SD大鼠,雄性,清洁级,200 250 g青岛市药 检所实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK (鲁） 20090007。1.2细胞株人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC,上海泛柯生物科技公司）细胞 株取自人脐带静脉组织,为原代冻存细胞。1.3药品与试剂4种岩藻聚糖硫酸酯（中国海洋大学食品科学 与工程学院）。相对低相对分子质量岩藻聚糖硫酸 酯（low molecular weight fucoidan, LMWF) : LF1 (相对 分子质量3 700,硫酸根含量30. 7%) ; LF2 (相对分 子质量7 300,硫酸根含量32.5%);相对中相对分 子质量岩藻聚糖硫酸酯（middle molecular weight fucoidans, MMWF) ：MFa (相对分子质量19 000,硫酸 根含量28.5%) ; MFb (相对分子质量28 000,硫酸 根含量34.6%)。分别用生理盐水配成0.6 mol L-1溶液备用。血管性血友病因子测定药盒（上海 船夫生物科技有限公司）；水合氯醛、磷酸盐缓冲液 (PBS)及其他试剂均为国产分析纯。大鼠抗人单克 隆抗体 CD31PE、CD514TTC (美国 Invitrogen 公 司）;高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；小牛血 清（杭州四季青生物工程材料公司）;胰蛋白酶（美 国DFICO公司）；肿瘤坏死因子（TNFa)(华美生 物工程有限公司）；鞘液（美国BECKMAN COULTER 公司，ISOTON 1);标准荧光微球（美国BECK- MAN COULTER 公司 , FLOW-CHECK) 。1.4主要仪器全自动石蜡切片机（德国SLEE公司，6022 型）;光学显微镜（OLMRAS公司，日本）；高速冷冻 离心机（上海安亭科学仪器厂,TGL -16G-A);全 自动酶标仪（BECKMAN COULTER公司,AD340,美 国）；CO2孵育箱（美国Themro Fomra公司， Model311);流式细胞仪（美国 BECKMAN COULTER 公司，Epics XL MCL)。2方法2.1分组与给药大鼠随机分为正常对照组、模型组和4个岩藻 聚糖磷酸酯组（分别为LF1组、LF2组、MFa组和 MFb组），每组10只，全部为雄性。正常对照组和 模型组腹腔注射给予1 mL 100 g-1生理盐水,其他 各组分别腹腔注射给予岩藻聚糖硫酸酯0. 01 mol kg-1,每日1次,持续5 d。2.2大鼠内皮损伤模型制作&3各岩藻聚糖硫酸酯实验组和模型组分别在每日 早、中、晚于背部相同部位皮下注射肾上腺素（0.4 mg kg 1),正常对照组皮下注射等量生理盐水，持 续5d。每日早晨给药1h后麻醉,腹主动脉取血约2mL,置枸橼酸钠抗凝管（抗凝剂与血样体积比为 1:9)中备用。2.3病理学切片制作大鼠取血后,快速分离胸主动脉,先用磷酸盐缓 冲液冲洗干净管腔内的血液，再用4%多聚甲醛固 定24 h。横截切取主动脉弓下血管段约0.5 cm,经 包埋后切片，切片厚度5 pm。经HE染色后,进行脱 水透明、封固，备用。2.4内皮损伤情况切片观察和血管性血友病因子 (vWF)的测定内皮损伤情况切片观察：将病理学切片置光学 显微镜下观察内皮损伤情况。大鼠血浆vWF的测 定:将抽取的各时段抗凝血,3 000 r min-1,离心10 min。采用酶联免疫法（ELISA)按照试剂盒操作说 明，测定血浆VWF水平。2.5人脐静脉内皮细胞的培养a14a细胞复苏后,加入高糖DMEM培养液约5 mL, 培养瓶中接种,每3 4 d换液1次。待内皮细胞生 长铺满瓶底后即可传代。吸去培养基，用无血清 RPMI 1640 2 mL洗培养瓶1次。加入0. 1%胰酶、0.02%EDTA-Na- 3 mL,放 CO2孵育箱（5% CO2, 37 C)中培养,隔天换液,约4 d进行1次消化传代。取 对数生长期细胞,经消化、离心后,弃去上清液,加入 冻存液,调节细胞约为1 x 107个 L1,冷冻,备用。2.6 vWF和EMPs指标检测2.6.1vWF水平检测0 将上述培养的内皮细胞 2113 Chin Pharm J, 2015 December, Vol. 50 No. 24按5 x105接种于24孔细胞培养板,并随机分为下列 各组,每组样本数为8。接种24 h后弃全部上清液， 按以下实验分组要求加入实验培养液:正常对照 组:加入完全培养液;模型组:培养液中加入肾上 腺素,使最终质量浓度为10 mg L-1;LF1组:培养 液中加入LF1和肾上腺素,使最终浓度分别为0. 01 mol L-1和10 mg L-1;LF2组:培养液中加入 LF2和肾上腺素,使最终浓度分别为0. 01 mol L-1 和10 mg L-1;MFa组:培养液中加入MFa和肾上 腺素,使最终浓度分别为0.01 mol L-1和10 g L-1;MFb组:培养液中加入MFb和肾上腺素,使最 终浓度分别为0. 01 mol L-1和10 g L-1。分别在加药后的24和48 h取100 L上清液， 采用酶联免疫吸附试验（ELISA),按照试剂盒说明 测定vWF水平。2.6.2EMPs检测将体外培养生长良好的内皮细 胞按5 x105个接种于24孔细胞培养板,并随机分为 下列各组,每组样本数为3。接种24 h后弃去上清 液,按以下实验分组要求加入实验培养液:正常对 照组：加入完全培养液；模型组：培养液中加入 TNF-a( 100 ng mL-1)；LF1组：培养液中加入 LF1和TNFa,使最终浓度分别为0. 01 mol L-1 和100 ng mL-1;LF2组：培养液中加入LF2和 TNFa,使最终浓度分别为0.01 mol L-1和100 ng mL-1;MFa组：培养液中加入MFa和TNF- a,使最终浓度分别为0.01門l L-1和100 ng mL-1;MFb组：培养液中加入MFa和TNFa,使 最终浓度分别为0. 01 mol L-1和100 ng mL-1。药品加入完成后，于37 C剌激人脐静脉内皮细 胞24 h ,按文献1344方法采用流式细胞仪进行 检测和分析。2.7数据统计分析与处理各组数据以x s表示，用SPSS11. 5统计分析 软件,以单因素方差分析和q检验进行统计比较。3结果3.1光学显微镜下病理检查结果造模5 d后，各组胸主动脉HE染色后切片的 光学显微镜下结果见图1。正常对照组胸主动脉有 较完整的内皮层，表面光滑;模型组可见内皮层有严 重的脱落或断裂；而LF1组合LF2组有内皮层断 裂,未见脱落现象；MFa组合MFb组有内皮层有少 许断裂,分离现象，内皮损伤较LF1和LF2组较重， 但较模型组为轻。说明反复注射较大剂量的肾上腺2114 Chin Pharm J, 2015 December, Vol. 50 No. 24素可造成血管内皮的损伤，而LMWF能够对抗这种 由肾上腺素造成的血管内皮损伤，具有内皮细胞保 护作用，且其内皮的保护作用明显强于MMWF。大鼠血浆vWF浓度大鼠注射肾上腺素的5 d时间里，正常对照组 的vWF水平基本没有变化。模型组的血浆vWF浓 度先降低,然后逐渐升高,在第5天与正常对照组比 较，出现明显差异（P 11本实验结果表明，LMWF对内皮细胞具有良好 的保护作用；而MMWF虽然对内皮细胞的损伤有所12改善,但这种保护作用远低于LMWF。同时可以推 断出，LMWF可通过降低EMPs浓度和vWF浓度，阻断血小板与受损血管部位的胶原结合,从而抑制 13 血小板活化,发挥保护内皮的作用。