《亲和纯化技术》PPT课件

亲和色谱定义 亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。物质的液相色谱法。亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和吸附介质（亲和吸附剂）亲和色谱原理亲和色谱原理 亲和色谱操作与一般的固亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作方式相似，定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端分析多采用断通式前端分析法，分为进料、杂质清法，分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱合层洗、目标产物洗脱合层析柱再生四步。析柱再生四步。亲和色谱原理亲和色谱原理n料液进料（料液进料（feedstock loadingfeedstock loading）含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产物在色谱柱出口穿透物在色谱柱出口穿透n杂质清洗杂质清洗(contaminant washing)(contaminant washing)利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液，利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液，清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；n产物洗脱产物洗脱(target product elution)(target product elution)利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物n柱再生（柱再生（column regeneration)column regeneration)利用清洗液清洗再生色谱柱利用清洗液清洗再生色谱柱亲和配基酶、抗体和蛋白亲和配基酶、抗体和蛋白n酶的抑制剂酶的抑制剂 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数为数为109 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为为4104 L/mol）。n抗体抗体 抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107 1012 L/moln蛋白蛋白A（或称（或称A蛋白）蛋白）A蛋白为分子量蛋白为分子量42 kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。它与动物免疫球蛋白胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。）具有很强的结合作用。亲和配基凝集素和色素亲和配基凝集素和色素n凝集素凝集素 凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。配基。n辅酶和磷酸酰苷辅酶和磷酸酰苷 各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。n三嗪类色素三嗪类色素 这类色素与这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生结合作用结合作用亲和配基过渡金属等亲和配基过渡金属等n过渡金属离子过渡金属离子 Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生亲和结合作用。亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与等过渡金属离子与N、O和和S等供电原子等供电原子产生配位键。产生配位键。n组氨酸组氨酸n肝素肝素 肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量为为5到到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。亲和色谱亲和色谱-亲和色谱介质应满足条件亲和色谱介质应满足条件n具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；n物理和化学稳定性高，有较高的机械强度物理和化学稳定性高，有较高的机械强度n含有可活化的反应基团含有可活化的反应基团n粒径均一的球形粒子粒径均一的球形粒子介质的活化方法溴化氰法介质的活化方法溴化氰法n溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配基基n最初的溴化氰活化法，需要加入最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至至pH为为11，成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是剧毒试剂，并且具有挥发性。剧毒试剂，并且具有挥发性。n溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非特异性吸附增加等。特异性吸附增加等。介质的活化方法环氧基法介质的活化方法环氧基法n环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性低的特点，是目前广泛采用的制备方法。低的特点，是目前广泛采用的制备方法。n活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和适当浓度的适当浓度的NaOH，然后振荡反应左右。，然后振荡反应左右。n为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和NaOH的用量，的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根的浓度，反应时间都可以根据具体实验做出调整。据具体实验做出调整。n由于环氧氯丙烷为油相，而由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为溶液为水相，为了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶剂二甲基亚砜（剂二甲基亚砜（DMSO）。）。亲和色谱亲和色谱-间隔臂的作用间隔臂的作用n当配基分子量较小时，为当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接要在配基和载体之间连接一个一个“间隔臂间隔臂”n间隔臂的长度有一定限制，间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱目标分子的亲和力会减弱亲和色谱亲和色谱-影响亲和吸附的因素影响亲和吸附的因素n杂质的影响杂质的影响 料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关料、配基固定化方法等众多因素相关n料液流速料液流速 流速的增大，分离速度加快，但柱效降低流速的增大，分离速度加快，但柱效降低亲和色谱亲和色谱-目标产物的特异性洗脱目标产物的特异性洗脱 特异性洗脱利用含有与特异性洗脱利用含有与亲和配亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物小分子化合物为洗脱剂，通过与亲为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。脱附目标产物。特异性洗脱条件温特异性洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活和，有利于保护目标产物的生物活性性。另外，由于仅特异性洗脱目标。另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较为严重的物系，或非特异性吸附较为严重的物系，特异性洗脱有利于提高目标产物的特异性洗脱有利于提高目标产物的纯度纯度。亲和色谱亲和色谱-目标产物的非特异性洗脱目标产物的非特异性洗脱 非特异性洗脱是提高洗脱液的非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强值、离子强度、离子种类或温度度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不可逆变性，需慎重使用。可逆变性，需慎重使用。亲和膜亲和膜-定义定义 亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。是固定床亲和层析的变型。亲和膜亲和膜-亲和膜的提出亲和膜的提出n固定床亲和层析的缺陷固定床亲和层析的缺陷 以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）放大困难（放大采用径向放大）n亲和膜思路提出亲和膜思路提出 “降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速”亲和膜亲和膜-亲和膜的原理亲和膜的原理 亲和配基固定在亲和配基固定在膜孔表面，流体在膜孔表面，流体在对流状态下透过膜对流状态下透过膜孔的过程中目标蛋孔的过程中目标蛋白与配基接触而被白与配基接触而被吸附吸附亲和错流过滤亲和错流过滤-定义定义 亲和错流过滤是生物亲和相互作用亲和错流过滤是生物亲和相互作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术子的分离纯化技术亲和错流过滤亲和错流过滤-原理原理n传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量大小的差异；分子量相差大小的差异；分子量相差10倍以上的物质可倍以上的物质可得到分离，选择性差；得到分离，选择性差；n将亲和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶将亲和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶性微粒后，目标蛋白质将选择性地吸附于这性微粒后，目标蛋白质将选择性地吸附于这些修饰亲和配基的材料上，从而在目标蛋白些修饰亲和配基的材料上，从而在目标蛋白质与杂蛋白之间形成较大的尺寸差，提高膜质与杂蛋白之间形成较大的尺寸差，提高膜分离选择性分离选择性n目标产物被截留并经洗脱获得纯品目标产物被截留并经洗脱获得纯品亲和错流过滤亲和错流过滤-特点特点n优点优点吸收膜分离的优点，易于放大和连续操作吸收膜分离的优点，易于放大和连续操作吸收亲和吸附高选择性的特点吸收亲和吸附高选择性的特点亲和载体无内扩散阻力，目标分子的亲和结合速度快亲和载体无内扩散阻力，目标分子的亲和结合速度快n缺点缺点一级吸附平衡、一个理论板、效果差一级吸附平衡、一个理论板、效果差其他亲和过程其他亲和过程-亲和双水相萃取亲和双水相萃取n亲和双水相萃取是利用偶联亲和配基的聚乙亲和双水相萃取是利用偶联亲和配基的聚乙二醇作为成相聚合物进行目标产物的双水相二醇作为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取萃取n在亲和配基的亲和作用下，促进目标蛋白在在亲和配基的亲和作用下，促进目标蛋白在PEG相中分配，提高分配系数和选择性相中分配，提高分配系数和选择性其他亲和过程其他亲和过程-亲和反胶团萃取亲和反胶团萃取 亲和反胶团是指在反胶团相中除通常的表亲和反胶团是指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为目面活性剂以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子亲和作用，促进目标亲和配基与目标分子亲和作用，促进目标产物在反胶团相分配。产物在反胶团相分配。其他亲和过程其他亲和过程-亲和沉淀定义亲和沉淀定义 亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离技相结合的蛋白质类生物大分子的分离技术，包括一次作用亲和沉淀和二次作用术，包括一次作用亲和沉淀和二次作用亲和沉淀。亲和沉淀。其他亲和过程其他亲和过程-一次作用亲和沉淀原理一次作用亲和沉淀原理n水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含有两个以上亲和结合位点有两个以上亲和结合位点n化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联n交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀其他亲和过程其他亲和过程-二次作用亲和沉淀原理二次作用亲和沉淀原理n利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质制备亲和沉淀介质n亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀使介质与目标分子共同沉淀