实用HPLC方法的建立

实用HPLC方法的建立目录1 前言2 HPLC方法建立的步骤3 选择仪器类型，确定检测器及其参数2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤1 了解样品的有关情况，明确分析目的7a 回 收 纯 化 物 质8 方 法 论 证 进 入 常 规 实 验 室7b 定 量 校 正7c 定 性 方 法6 检 查 出 现 的 各 种 现 象 和 问 题(包 括 仪 器、样 品 稳 定 性 等）选 择 解 决 办 法 和 特 殊 步 骤5 优 化 分 离 条 件，选 择 最 佳 检 测 器 参 数、色 谱 柱、流 动 相 比 例 等4 选 择 液 相 色 谱 分 离 类 型，色 谱 柱，流 动 相，其 他 相 关 条 件（如 波 长 等），进 行 预 实 验，估 计 最 佳 条 件2.1 了解样品的有关情况2.2 明确分析目的2.3 样品的预处理与检测2.4 HPLC分析模式2.5 色谱条件2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理2.7 定性和定量方法的建立及论证3 色谱条件的选择3.2 检测器的选择3.3 样品的溶解及预处理3.4 样品的进样量3.5色谱柱的选择及保护与再生n色谱柱的修复和再生-化学变化 IInExample:4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate:1 mL/min;Temp:80 A:0.1%TFA in water B:0.1%TFA in acetonitrile 100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 min.Repeat 3 times。n6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积。nXDB,有机聚合物等填料可使用高pH 水溶液/有机溶液，如：n0.01M NaOH 50%异丙醇/水溶液，硅胶基质应尽量减少接触时间(15-30 min)。3.6 泵的选择3.7 色谱工作站4 分析方法建立的实例4.1 4.1 等度分析等度分析色谱柱：C18，4mm30mm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：2ml/min.样品：对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改变容量因子 K60/4050/5040/60改变选择性a62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF4.2 梯度方法的建立梯度的洗脱方式溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）梯度洗脱的可变参数124356789 10 11如不用梯度：分离不理想梯度条件的优化梯度曲线的变化 凹线梯度曲线的变化 凸线梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复梯度平衡时间的影响（二）平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。有机污染物的影响（一）50ml超纯水的有机物污染状态有机污染物的影响（二）“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析有机污染物的影响（三）典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析梯度方法开发实例-第一步n开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好梯度方法开发实例-第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。梯度方法开发实例-第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。梯度方法开发实例-第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。梯度方法开发实例-第五步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。梯度方法开发实例-第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。梯度方法开发实例-第七步最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。4.3 色谱柱及pH的影响NHNHOONOHOOHNOOOOHOHNH2尿尿嘧啶嘧啶3-3-丁基丁基吡啶吡啶4-4-苯基苯基丁胺丁胺4 4-苯基丁酸苯基丁酸苯酚苯酚丙丙基苯基苯1,4-1,4-二羟基蒽醌二羟基蒽醌N,N-N,N-二二乙基间甲苯酰胺乙基间甲苯酰胺丁基丁基苯苯*4-Phenylbutylamine was not used for testing at pH 2.5*4-Phenylbutyric acid was not used for testing at pH 7苯苯基基aa芘芘1,2:3,4:5,6:7,81,2:3,4:5,6:7,8-四四苯基萘苯基萘菲菲3,4-c3,4-c并并菲菲nHPLC 条件条件-试验试验 2HPLC 条件条件 试验试验3Column:Alltima C18,5m,150 x 4.6mm1a碱碱灭活灭活1b非非碱灭活碱灭活1.尿嘧啶2.3-丁基吡啶3.苯酚4.4-苯基丁酸5.N,N-二乙基间甲苯酰胺(DEET)6.1,4二羟基蒽醌7.丙基苯8.丁基苯Column:Adsorbosphere C18,5m,150 x 4.6mm pH 2.5 的色谱图2a碱碱灭活灭活2b非非碱灭活碱灭活pH 7 的色谱图Column:Alltima C18,5m,150 x 4.6mmColumn:Adsorbosphere C18,5m,150 x 4.6mm1.尿嘧啶2.苯酚3.4-苯基丁胺4.N,N-二乙基间甲苯酰胺5.3-丁基吡啶6.1,4二羟基蒽醌7.丙基苯8.丁基苯pH2.5pH7.01.1.丙酮2.2.苯a芘 3.3.菲3,4-c并菲 4.4.1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘3 3a aPlatinumPlatinum C18,C18,5 5m,150 x 4.6mmm,150 x 4.6mm3 3b bNucleosilNucleosil C18 AB,C18 AB,5 5m,150 x 4.6mmm,150 x 4.6mm3 3c cInertsilInertsil ODS-2,ODS-2,5 5m,150 x 4.5mmm,150 x 4.5mm5 5 色谱分析中各种图谱现象的判断色谱分析中各种图谱现象的判断5.5.1 基线噪音的产生和处理基线噪音的产生和处理可能产生的原因及处理办法1 流动池脏，用极性试剂清洗。当有填料进入，拆开流通池。2 检测器灯有问题，如能量偏低，更换氘灯。3 周期性的波动，则起源于泵的脉冲，检修泵或更换垫片等。4 温度对检测器的影响，控制温度。5 气泡经过检测器，用大流量冲洗。6 可能难出峰的样品连续不断出来，用强极性流动相冲柱。7 流动相本底高，如水的纯度不够，换超纯水。或试剂纯度不够，换色谱纯的试剂。8 注意数据采样和连接问题。Time(min.)5.2 基线漂移（上漂和下漂）1 柱中的流动相没有平衡，延长平衡时间，尤其在流动相中添加了有紫外吸收的添加剂。2 在梯度洗脱中，基线上漂是正常的，在空白梯度中有可能是柱子中有杂质洗出。其次是流动相中有干扰物。换流动相。3 温度不稳定（示差检测器），控温。4 在等度分析中，样品缓慢洗出，改变淋洗液强度或用梯度分析。5 样品进入检测器，吸附在池中，可能每进样一次，本底一次比一次高，很少见。5.3 倒峰的产生和消除5.4 鬼峰的产生和消除5.5 峰前移或退后的判断5.6 前沿峰和拖尾峰的判断和处理5.8 色谱峰变胖的判断和处理