细胞培养概述ppt课件

第一章 细胞培养概述主讲:况海斌 Ph.D南昌大学医学院生理学教研室计划生育生殖内分泌研究室课程安排:n第一次：细胞培养发展史第一次：细胞培养发展史（略讲）、细胞培养室的设计（重点理解其原理，从而达到对细胞培养室要求的理解，如进出培养间要关好每一扇门）。实验器械清洗、包装和清毒实验器械清洗、包装和清毒（清洗要领、清洗液的配配制和使用的期限、包装的具体步骤：如何包装培养瓶，清毒的方式、压力与时间。n第二次第二次：实验室常用仪器、设备的使用与维护：净化台（使用的区域、物品的摆放、操作方式、消毒、秽物处理）；自动双重纯化水蒸馏器（使用与注意事项）；培养液的过滤器（简单与自动抽气泵的过滤器使用介绍、操作关键点）；清毒器（种类、消毒时间、压力、和注意事项），CO2培养箱（使用及注意事项）；干燥箱；液氮生物容器；冰箱；显微镜；倒置显微镜；荧光显微镜；天平；酸度计；电泳仪；PCR仪；离心机；振荡器，摇菌摇床等相关设备。n第三次：细胞培养用液及培养液（基）：第三次：细胞培养用液及培养液（基）：水的要求；平衡盐溶液（种类与配制）；消化液（种类与配制）；谷氨酰胺补充液；抗生素溶液的配制；培养基颜色要求与变化代表的意义；小牛血清的批号、灭活与分装；天然培养基；常见合成培养基种类、如何配制、分装与贮存。n第四次：细胞培养的基本技术：第四次：细胞培养的基本技术：原代细胞分离（培养前准备、无菌操作的注意事项具体的流程）、培养（酶消化法和组织块培养法、如何计数、接种密度）。细胞生长状况的观察（培养液颜色与透明度的变化、细胞生长状况、细胞形态变化、微生物污染、体外培养细胞的生长类型、细胞培养中的常用术语）；培养细胞一代生长过程（分期及特点）；盖玻片条细胞培养法；细胞传代（消化酶、传代的比例、及注意事项）；冻存与复苏（冻存和复苏的原则：慢冻快融；冻存和复苏具体操流程）。细胞培养注意事项（如细胞污染判断、观察与处理原则）。n第五次：细胞培养的研究方法：第五次：细胞培养的研究方法：活力的检测（死、活细胞鉴别；凋亡细胞检测）；细胞增殖实验（MTT法、MTS法以及BrdU法）；细胞和细胞器分离与培养（速度、等密度、流式细胞分离技术）；细胞形态学研究方法（细胞固定、常用染色法、细胞免疫组化，免疫荧光法）；细胞克隆技术（细胞克隆形成试验）。n第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（如心肌分离与培养、从作者论文来分析论文设计及实验操作关键过程）。n第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的流程和相关的指标）流程和相关的指标）。n第八次：细胞转染技术第八次：细胞转染技术（质粒序列选择、酶切位点选择及引物设质粒序列选择、酶切位点选择及引物设计、计、如何连接、接种，挑选阳性菌进行PCR扩增和测序，以及产物鉴定。磷酸钙共沉淀法基因转染、脂质体转染法。了解病毒转染法和RNA干扰技术。）n第九次：胚胎技术：第九次：胚胎技术：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集程序、小鼠胚胎培养步骤、小鼠胚胎与小鼠子宫上皮共培养步骤、小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离培养、小鼠外胎盘锥的培养、外胎盘锥与蜕膜细胞的共培养、人绒毛的分离与培养、胚胎移植技术、显微操作技术）n第十次：参观与讨论：第十次：参观与讨论：主要参考书：主要参考书：n1.动物细胞培养技术作者：程宝鸾，出 版 社：中山大学出版社n2细胞培养 作者：司徒镇强，吴军正出 版 社：世界图书出版公司n3.小鼠发育生物学与胚胎实验方法作者：金岩 出版社：人民卫生出版社n4.小鼠胚胎操作实验手册 作者：安德拉斯.纳吉 翻译:孙青原主要内容:一、细胞培养发展史（略讲）:二、细胞培养室的设计（重点理解其原理）:三、细胞培养实验室无菌的基本要求:四、如何准备一次实验(实验器械清洗、包装和清毒):一、组织培养发展简史一、组织培养发展简史（一）发展史（一）发展史 n1878 Claude Bernard:1878 Claude Bernard:证明一个器官在个体死亡以后仍然可以人工维持。n1885 Wilhelm Roux:首次采用了“Tissue culture”这个名词。n1887 Ross Harrison:1887 Ross Harrison:利用的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了 Ross Harrison被称为细胞培养之父。Ross Harrison早期培养n1898年 Ljunggren 将人体皮肤保存在腹水腹水中几天至几周后再移植手术获得成功。n1903年Jolly 用玻片悬滴法培养蜂螺白细胞存活近一个月n1906年Beebe等 用动物血清动物血清培养狗的传染性淋巴瘤细胞达72小时。n1910 Burrows:率先在血浆凝块血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.培养器材：nHarrisonHarrison（19061906）通过采用单盖片悬滴培养法）通过采用单盖片悬滴培养法,用淋巴液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织从此标志着体外培养组织细胞的基本模式的建立。细胞的基本模式的建立。nCarrel（1923）设计了卡氏培养瓶卡氏培养瓶，进一步研究细胞的营养问题。nStrengeway（1926）设计了表玻璃表玻璃培养法，为研究动物器官在体外的发育与功能作出贡献。n以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。组织培养发展示意图组织培养发展示意图 n1948 Fisher:研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006，该培养液至今还在使用。该培养液至今还在使用。n1951年年Eagle 开发了能促进动物细胞体外培养的人工合开发了能促进动物细胞体外培养的人工合成培养基。成培养基。n1952 Gey 和同事：分离培养了Hela细胞。n1952 Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。培养基（液）：培养基（液）：n1955年年 Dulbecco发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞的方法，建立了单层细胞培养技术。的方法，建立了单层细胞培养技术。n1961 Hatflick&Moorhead:显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。n1965 Ham:配制了第一个无血清培养液。配制了第一个无血清培养液。n1975 Kohler&Miltein:成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。（二）我国组织、细胞培养的发展：（二）我国组织、细胞培养的发展：（三）细胞培养的优点：（三）细胞培养的优点：1 1、活细胞、活细胞：能能长时间长时间、直接观察直接观察、研究、研究活细胞活细胞的形态、结构、的形态、结构、生命活动生命活动。2 2、可控制：、可控制：选择对象选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段）：均一性、重复性（类型、性质、阶段）调节条件调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）：各种因素（物理、化学、生物等因素）利用方法利用方法：研究技术、记录方法：研究技术、记录方法 3 3、应用广：、应用广：领域多领域多：医学研究、生物技术、基因工程等：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广对象广：各种动物（低等动物：各种动物（低等动物-高等动物高等动物-人类）人类）一种动物（不同年龄、不同组织）一种动物（不同年龄、不同组织）正常或异常（肿瘤）正常或异常（肿瘤）4 4、较经济：、较经济：可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。似的实验对象。（四）细胞培养的缺点：（四）细胞培养的缺点：人工模拟的培养环境与体内相比仍然人工模拟的培养环境与体内相比仍然存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态或功能会发生不同程度的改变。或功能会发生不同程度的改变。与体内主要不同与体内主要不同 相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液神经体液的调节和细胞相互间的影响。的调节和细胞相互间的影响。主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形态、失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱分化减弱、细胞、细胞趋向趋向单一化单一化。提示提示 要正确认识体外培养细胞是一种要正确认识体外培养细胞是一种特定条件特定条件下生长下生长的细胞群体。的细胞群体。二、二、细胞培养室的设计细胞培养室的设计（一）细胞培养的必备设施（一）细胞培养的必备设施 无菌实验室无菌实验室 超净工作台超净工作台 恒温培养箱恒温培养箱 其他设备其他设备 （电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）滤装置等）1 1、无菌实验室：、无菌实验室：n设计原则：防治微生物污染和有害设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。气清新、干燥和无烟尘。1 1、无菌实验室：、无菌实验室：n总的要求：抽风过滤系统总的要求：抽风过滤系统无菌实验室：无菌实验室：n组成：组成：更衣间：更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。缓冲间：缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与位于更衣间与操作间之间，也可同时与 几个操作间相通。几个操作间相通。操作间：操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房放在内间，供无菌操作和细胞培养，房 间不受日光直射，大小适宜，高间不受日光直射，大小适宜，高2.5m2.5m。2 2、超净工作台：、超净工作台：n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。其它老师专门讲述实验室仪器：恒温培养箱恒温培养箱其他设备其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）消毒器、抽滤装置等）3、如何维护无菌环境：保持无菌的基本要求：保持无菌的基本要求：（1）实验前准备：）实验前准备：n分门别类制定操作卡片，实验前按卡片分门别类制定操作卡片，实验前按卡片收集、清点、清洗及消毒所需物品，一收集、清点、清洗及消毒所需物品，一并放入并放入实验器材准备数实验器材准备数要大于使用数，瓶盖数要大于瓶数。要大于使用数，瓶盖数要大于瓶数。（2 2）无菌室及操作野消毒）无菌室及操作野消毒n实验前实验前无菌室及无菌操作台无菌室及无菌操作台(超净台超净台)以以紫外灯照射紫外灯照射3030分钟灭菌，打开抽风系统，分钟灭菌，打开抽风系统，抽风大约抽风大约2020分钟，进入培养室。分钟，进入培养室。n以以70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作台面，并擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转开启无菌操作台风扇运转10 10 分钟后，才分钟后，才开始实验操作。开始实验操作。(3)(3)无菌操作无菌操作要求要求n无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。以利于气流之流通。n实验用品以实验用品以70%ethanol 70%ethanol 擦拭后才带入无菌擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。域，勿在边缘之非无菌区域操作。(3)无菌操作要求：n小心取用无菌之实验物品，避免造成污小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验亦不要在打开之容器正上方操作实验.n容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约倾斜约4545角取用，尽量勿将瓶盖盖口角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。朝上放置桌面。n试剂用后立即封闭瓶口。试剂用后立即封闭瓶口。n专管专用，勤换吸管。专管专用，勤换吸管。n瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用干瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用干酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。n盖瓶时瓶口和瓶盖经火焰消毒。盖瓶时瓶口和瓶盖经火焰消毒。(4)实验后要求实验后要求n实验完毕后，将实验物品带出工作台，以实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作抬面擦拭无菌操作抬面n（一般先用加入新洁而灭或（一般先用加入新洁而灭或8484的液体清的液体清洗）。洗）。n关闭超净台灯、风和电源。关闭超净台灯、风和电源。n未使用过的器材放入饭盒中，用过的器材未使用过的器材放入饭盒中，用过的器材清水浸泡。清水浸泡。四、如何准备一次实验四、如何准备一次实验n分门别类制定操作卡片，实验前按卡片分门别类制定操作卡片，实验前按卡片收集、清点所需物品，收集、清点所需物品，进行相应清洗、进行相应清洗、包装与消毒。包装与消毒。n实验器材准备数要大于使用数实验器材准备数要大于使用数（瓶盖数（瓶盖数要大于瓶数）。要大于瓶数）。（一）一般需要准备物品：n1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。n2、离心管、吸管、盖子、TIP管、冻存管、烧杯、量筒、容量瓶、饭盒,培养皿n3、枪头（TIP头）n4、培养板与培养皿n5、手术器械。（二）实验器材的清洗、包装和消毒（二）实验器材的清洗、包装和消毒干燥：n50-560C 清洁液的配制2、包装、包装n 组织培养的器皿要清洗晾干。在消组织培养的器皿要清洗晾干。在消毒前必须进行包装，以便消毒及储存，毒前必须进行包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装的方法：物理方法干热消毒n在烤箱中进行，在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要用较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，需加温到160，保持90120min方能杀死芽胞。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。湿热消毒n是一种很有效的消毒方法，一般使用高压蒸汽灭菌器进行。高压消毒可在50、10、15、20磅的压力下进行，持续时间可为10、15、20、30min。根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是15磅20min，有些常规使用液体要消毒15磅15min，橡胶用品为10磅10min。n煮沸消毒可用于注射器及某些用具的快速消毒，缺点是湿度太大。n故湿热消毒后要进行干烤：n但过滤器不能干烤。紫外线消毒n紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。n但在房内安装不能高于2.5米，要使各处能有0.06微瓦/cm2能量照射，否则影响消毒效果。n也可以用紫外线消毒一些塑料培养器皿。缺点是有臭氧产生，污染空气，影响身体健康。过滤除菌消毒n 有很多组织细胞培养使用的液体不能采用高压消毒的方法进行灭菌处理，目前培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等具有生物活性物质的液体等，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能。n因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。滤器有抽吸（抽滤）式及加压式两种类型；滤板（或滤膜）结构可为石棉板、玻璃或微孔膜。常用的滤器nZeiss滤器n玻璃滤器n微孔滤膜滤器n 这种滤器的基本结构为金属结构，其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂滤膜。可用于包括血清在内的各种培养液体的过滤除菌，速度较快，效果较好，现已为许多实验室所使用。滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大小而划分其型号，可按待滤过液体的量来选择适当的型号。用于小量培养液时，可选用2.5cm直径滤器，以注射器推动为压力而过滤。微孔滤膜滤器可为加压式（正压式）或抽滤式，以加压式更佳。n以滤过除菌时，最好使用 0.22m孔径的滤膜（可以除去细菌和霉菌）。由于滤膜很薄，在滤器的上层和下层的相应部位各有一凹槽以放置一硅胶垫圈来固定、压紧滤膜。安装滤膜时要注意；滤膜薄而且光滑，容易移动，千万不能装偏而使过滤失败；同时要注意滤膜的正反面，正面（光面）应向上。由于滤膜薄，承受压力有限，力量不能过大、过猛，以免造成滤膜破裂。如何安装微孔滤膜滤器：化学方法 n消毒剂 组织细胞培养工作中也可利用消毒剂来进行灭菌处理，消毒剂主要是75%酒精、过氧乙酸、乳酸、来苏儿等化学制剂。可分别用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面，实验室的椅、桌、墙壁、地面及空气等的处理。如：75%酒精最为常用，用途也最广泛；0.1%新洁尔灭可以对器械、皮肤、操作表面进行擦试和浸泡清毒；乳酸可用于空气消毒；来苏儿对皮肤有刺激性，可用于地面的消毒；过氧乙酸是一种新的消毒剂，消毒能力很强，在0.5%浓度下，10min可将芽孢菌杀死。n n抗菌素也常在组织细胞培养工和中使用，但多数是为了预防。要注意的是不能完全依赖抗菌素来达到消毒灭菌。常用的抗菌素为青霉素及链霉素。小结：消毒方法的选择n实验室中空气的消毒实验室中空气的消毒，最理想是采用过滤系统，并与恒温设备结合使用，但价格较贵。亦可用紫外线消毒，但安置紫外线灯时要符合要求（使用寿命指UV灯管在相同能量输入而产生的可利用紫外线强度不够）。另外尚可用乳酸等蒸气或电子灭菌灯消毒。n实验台的消毒处理实验台的消毒处理，最常用的是以酒精擦拭，亦可以紫外线照射。消毒方法的选择：n培养器械的消毒：培养器械的消毒：多数培养用的器材常用干热或湿热消毒，不能耐高温的塑料制品，可用消毒剂浸泡或紫外线照射。n培养用液体的消毒：培养用液体的消毒：盐溶液及一些不会因高温破坏其成份的溶液，常采用高压蒸汽消毒。血浆、血清等生物性的天然培养基，不能以高压蒸汽消毒，必须用过滤方法除菌；合成液体培养基也采用过滤除菌的方法。5、准备相应的实验：n第一讲内容：超净台n n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤 器 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培 养 板 培养瓶图图3-1 3-1 研究用标准细胞培养实验室参考平面图研究用标准细胞培养实验室参考平面图实验服、拖鞋实验服、拖鞋气气塞塞门门层流层流净化净化罩罩水池水池pHpH计计天平天平离心机离心机离心离心机机显微显微镜镜显微显微镜镜顶顶柜柜层流净化台层流净化台层流净化台层流净化台层流净化台层流净化台垂直叠放垂直叠放培养培养箱箱层流净化台层流净化台垂直叠放垂直叠放培养培养箱箱离心机离心机-20无菌贮藏柜无菌贮藏柜4显微镜显微镜显微镜显微镜计数仪计数仪顶柜顶柜无菌贮藏柜无菌贮藏柜无菌贮藏柜无菌贮藏柜无菌贮藏柜无菌贮藏柜恒温恒温培养箱培养箱恒温恒温水浴锅水浴锅垂直叠放垂直叠放培养培养箱箱垂直叠放垂直叠放培养培养箱箱液氮生物容器液氮生物容器必需设备必需设备清洗设备清洗设备浸泡缸或浸泡槽浸泡缸或浸泡槽深洗槽深洗槽吸管缸吸管缸吸管清洗器吸管清洗器高、低温干燥烘箱高、低温干燥烘箱灭菌器灭菌器(高压蒸汽灭菌器、高压锅高压蒸汽灭菌器、高压锅)干热灭菌烘箱干热灭菌烘箱4冰箱冰箱-20冰箱冰箱天平天平蒸馏水器蒸馏水器纯水仪纯水仪超净工作台超净工作台CO2培养箱培养箱5CO2钢瓶钢瓶(用于通气培养用于通气培养)液态液态CO2钢瓶钢瓶倒置显微镜倒置显微镜台式离心机台式离心机液氮生物容器液氮生物容器(约约35 L，放，放15003000个冻存管个冻存管)液氮储存容器液氮储存容器(约约2535 L)用于细胞冷冻的低速冷冻器用于细胞冷冻的低速冷冻器用于细胞悬浮培养的磁力搅拌器用于细胞悬浮培养的磁力搅拌器血球计数器血球计数器有益的非必需设备有益的非必需设备磁力搅拌器磁力搅拌器pH计计蠕动泵或真空泵蠕动泵或真空泵移液器移液器移液塞移液塞温室温室温度记录仪温度记录仪(用于灭菌烘箱、高压蒸用于灭菌烘箱、高压蒸汽灭菌锅汽灭菌锅)生物显微镜生物显微镜体视显微镜体视显微镜相差显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜吸管干燥器吸管干燥器自动分装器自动分装器台车或手推车台车或手推车旋转架旋转架(用于转瓶培养用于转瓶培养)CO2管道供气设备管道供气设备CO2钢瓶自动转换装置钢瓶自动转换装置细胞计数器细胞计数器 有用的辅助装置有用的辅助装置 玻璃器皿清洗机玻璃器皿清洗机-70-80冰箱冰箱电导仪电导仪渗透压仪渗透压仪聚乙烯袋封口机聚乙烯袋封口机(用于包装长期保存用于包装长期保存的无菌物品的无菌物品)计算机计算机(图象储存、冷冻仪记录、细图象储存、冷冻仪记录、细胞系基本数据处理胞系基本数据处理)打印机打印机集落计数器集落计数器大容量离心机大容量离心机(6 Lxl L)离心分选机离心分选机离心机和转子离心机和转子显微镜视频摄像和显示器显微镜视频摄像和显示器定时视频装置定时视频装置细胞大小测量仪细胞大小测量仪便携式温度记录仪便携式温度记录仪塑料切碎器塑料切碎器废物灭菌器废物灭菌器程序冷冻仪程序冷冻仪荧光激活的细胞分选仪（如流式细胞荧光激活的细胞分选仪（如流式细胞仪）仪）共聚焦显微镜共聚焦显微镜微量滴定板微量滴定板闪烁计数器闪烁计数器 表3-3 培养器皿特性表3-3 培养器皿特性培养器皿培养器皿培养物备份培养物备份每孔面积每孔面积/cm2每孔推荐每孔推荐液体量液体量/ml预计的预计的HeLa细胞产量细胞产量多孔板多孔板微量滴定板微量滴定板960.320.1l105微量滴定板微量滴定板1440.320.111054孔板孔板42251056孔板孔板69.624210612孔板孔板124.513110624孔板孔板2420.52510548孔板孔板4810.25196孔板孔板9610.050.1培养器皿培养器皿培养物备份培养物备份每孔面积每孔面积/cm2每孔推荐每孔推荐液体量液体量/ml预计的预计的HeLa细胞产量细胞产量培养皿直径培养皿直径30 mm16.921.710635 mm19.623210650 mm117.534410660 mml2l35510690nnn149101107培养器皿培养器皿培养物备份培养物备份每孔面积每孔面积/cm2每孔推荐液体每孔推荐液体量量/ml预计的预计的HeLa细胞产量细胞产量培养瓶培养瓶10号号1102210625号号1255510675号号l7510502107125号号l125251005107150号号l150251006107175号号l175501007107225号号1225501001108滚瓶滚瓶18502002.5108搅拌瓶搅拌瓶500 ml(机械搅拌机械搅拌)15051075 000ml(吹气搅吹气搅拌拌)140004109表表3-1 细胞培养实验室基本基础条件细胞培养实验室基本基础条件最低要求最低要求理想的条件理想的条件有用的附加条件有用的附加条件与动物房和微生物实验室隔离与动物房和微生物实验室隔离洗刷区洗刷区(不一定设置在细胞培养实验室内，但至不一定设置在细胞培养实验室内，但至少应邻近细胞培养实验室少应邻近细胞培养实验室)准备区（有进行各种准备工作的基本条件）准备区（有进行各种准备工作的基本条件）储存区（至少满足储存区（至少满足44和和-20-20贮存条件，化学贮存条件，化学试剂干燥、密封保存；有放置玻璃器皿和塑料试剂干燥、密封保存；有放置玻璃器皿和塑料制品的架子或柜子；带抽屉的工作台；专用小制品的架子或柜子；带抽屉的工作台；专用小件仪器设备橱柜）件仪器设备橱柜）无菌区（能保持清洁、安静、无过道）无菌区（能保持清洁、安静、无过道）有专门放置培养箱、有专门放置培养箱、COCO2 2钢瓶和液氮生物容器的钢瓶和液氮生物容器的位置位置空气经过过滤空气经过过滤各房间互相分隔各房间互相分隔无菌室单独隔开无菌室单独隔开操作台靠近培养区操作台靠近培养区培养室可控温或有培养室可控温或有温度记录温度记录钢瓶存放区隔离钢瓶存放区隔离管道输送管道输送COCO2 2负压管道负压管道有专门的储存间有专门的储存间足够容积的液氮储存生足够容积的液氮储存生物容器和单独的存放室物容器和单独的存放室显微镜室显微镜室暗室暗室无菌操作区与培养区分无菌操作区与培养区分开开可进行生物危害工作的可进行生物危害工作的防范室防范室(改自：改自：英英R.I.费雷谢尼费雷谢尼,著著.章静波章静波,徐存栓徐存栓,等等 译译.动物细胞培养动物细胞培养基本技术指南，基本技术指南，2004)