发酵法生产番茄红素

发酵法生产番茄红素摘要番茄红素是由11个共轭双键及2个非共轭碳碳双键构成的高度不饱和直链型烃类化合 物，具有预防癌症、防治心血管疾病、缓解骨质疏松症和提高免疫等重要的生理功能。番茄 红素的生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物发酵法。由于番茄红素含量低，提取法 无法满足市场需求；化学合成法存在收率低、产物不稳定以及合成成本高等缺点；发酵法被 认为是生产番茄红素最有潜力的方法，文中对发酵法生产番茄红素的关键技术环节(如菌种选 育、发酵工艺优化和分离纯化)的研究进展进行了阐述。关键词番茄红素，发酵工程，菌种选育，发酵工艺优化，分离纯化番茄红素是存在于自然界中的一种天然色素,呈红色, 因最早发现于番茄中得名。番茄红 素(Lycopene)是类胡萝卜素(Carotenoid)的一种。主要存在于植物细胞的有色体中，其中番 茄中含量最高，达3-14mg/100g，是由ll个共轭双键及2个非共轭碳碳双键构成的高度不饱和直 链型烃类化合物，分子式C40H56，分子量536.85。番茄红素结晶为暗赤色针状或柱状晶，熔 点175C，易溶于氯仿、苯，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，难溶于甲醇、乙醇，不溶于 水。性质十分活泼，易受氧、紫外线、温度的影响而迅速氧化。在酸性环境和有CO2存在的条 件下以及温度低于50C的酸性条件下，色素性能稳定。在自然界中番茄红素主要存在于番茄、西瓜等蔬菜水果中。1903年Schundc发现番茄中提 取的番茄红素的吸收光谱不同与胡萝卜素，将其命名为Lyco-pene。番茄红素是类胡萝卜素生 物合成途径中的一个中间代谢产物。美国学者最近发现秋橄榄浆果所含的番茄红素相当于番 茄的1.8倍。番茄红素与其他类胡萝卜素一样，动物自身不能合成。由于番茄红素没有类似胡 萝卜素那样的芷香环而没有VA活性,在过去一直不被重视。然而，近年研究发现其具有优越的 生理功能:在类胡萝卜素中，其抗氧化作用最强。其对单线态氧的淬灭作用是B-胡萝卜素的2 倍,维生素E的100倍。同时还具有防病抗癌，增强机体免疫力和抗衰老等生理功能,在食品、化 妆品以及医药领域具有重要用途,具有较高的开发和应用价值。 目前世界上番茄红素的开发生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。以色列、 日本、瑞典、瑞士、美国、法国和澳大利亚等国家以及罗氏、巴斯夫等跨国公司在此方面处 于领先地位,但目前只在以色列实现了从鲜番茄中提取的商业化生产。由于番茄中的番茄红素 含量很低,而且天然提取法产率低且价格昂贵,无法满足需求，而化学合成法成本虽有所下降 但存在一定不安全性。随着生物技术的快速发展,利用微生物发酵生产番茄红素成为目前的研 究热点之一。1番茄红素的生产方法番茄红素的生产方法主要有提取法、化学合成法及发酵法。11提取法在自然界中番茄红素主要存在于番茄、番石榴及西瓜等蔬菜水果中。尤其在番茄中，番 茄红素主要存在于番茄的表皮中，含量为(8. 842. 0)X10 mg/g(鲜重)。以提取法从番茄 中提取番茄红素产率低，且生产受季节影响明显，加之价格昂贵，无法满足市场需求。1.2化学合成法化学合成番茄红素主要是Wittig反应法，以假紫罗兰酮为原料合成三苯基氯化磷，三苯基氯化磷与辛三烯二醛、甲醇在2-丙醇中反应。化学合成法由于双键立体选择性难以控制致 使产物不可控，且使用的化学试剂在产品中会有不同程度的残留。番茄红素作为一种药或功 能食品，对纯度有较高的要求，而且大量化学试剂的使用会造成环境污染，从而限制了产品 质量及使用范围。MevaJ)nate 甲戊二號戢D-Glvc#r aJdebydt-3 - phosphate甘油2磷酸1 -Deoxy-D-xylUoe-5-ph0sphate1-,脱氧-D-木舸糖d-磷權Acetoacetyl CoA酰乙C-oAHMGCoA2 X Mctliy 1-D -erythritol 4-phuspIute 2甲越D-赤蒔糖雜*璘酸胡曹卜素是由葡萄糖转化而卜胡萝卜索来。番茄红素的类异戊二烯代谢途径合成过程详见图域番茄红素经环化酶作用可形成多种类 胡萝卜素。对革兰氏阴性菌欧文氏菌代谢途径的研究发现从法呢基焦磷酸(FPP)合成番茄红素 是由3个crt基因(crtE,crtB,crtl)控制13 发酵法发酵法利用特定微生物的代谢将淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉等廉价原料转化为番茄红素 不受原材料、地理环境和气候等因素影响，工艺简单、生产周期短、生产效率高、生产成本 低，且产物质量可控，并减少了对环境的污染。最重要的是发酵法生产的番茄红素属于天然 型产品，其活性与天然植物提取的活性成分一致，且与合成法生产的相比易于人体吸收。下 面着重对发酵法生产番茄红素的关键技术环节，如菌种选育、发酵工艺优化以及下游分离纯 化技术进行综述，并对发酵法生产的趋势进行了展望。2发酵法生产番茄红素21菌种选育用于发酵法生产番茄红素的微生物主要为三抱布拉氏霉菌(Blakeslea trispOm),经基因 改造的酵母菌(Saccharomyces),红色细菌(Rhodobacillus palustris)以及革兰氏阴性非 光合菌。菌种选育通常采用诱变育种的方法，Mehta等采用亚硝基胍对野生三抱布拉氏霉菌(B.z, OTa):菌株(+)F986和菌株(一)F921进行突变改良，获得两性突变体菌株，番茄红素的含量为 15 mg/g,较出发菌株提高了1.2倍。此外还可通过基因工程技术，构建高产工程菌株生产番 茄红素。Alper等采用基于化学计量学模型的系统方法结合基于转座子的组合法的靶基因敲除 技术构建了一个番茄红素过量表达大肠杆菌工程菌株，在摇瓶中经过48h培养番茄红素含量达 18mg/g，较出发重组菌株E. coliK12增加了8. 5倍。Yoon等利用质粒pBAD24建立携带欧文氏 菌(crtE, crtB, crtl)和雨生红球藻(ipiHP1)控制番茄红素合成基因的载体pTLYCm4和 pSSN12Didi，将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)后，使番茄红素的含量达22mg/g，产量 达 102mg/L，较出发菌株(crtE, crtB, crtl, ipi l, pTLYCm4)(17mg/g)含量提高0. 3倍。 为目前文献报道基因工程菌最高的番茄红素含量。但是诱变菌种的生产性状不稳定，导致番茄红素的产量低，而基因工程技术虽可以从实 验室规模走向小规模产业化，但由于工程细胞所携带的质粒对于过程控制条件要求苛刻，那 么在中试规模甚至大规模产业化过程中，其所携带的质粒容易脱落，从而导致产量大幅降低， 是严重制约番茄红素工程生产菌种走向产业化的瓶颈。在产业化过程中，研究者更多的倾向 于选择天然生产菌种，如具有较高生产能力的三抱布拉氏霉菌(B. trispora)，这样就可以避 免发酵工程上游技术中容易遇到的问题。2.2发酵工艺优化 2.2.1培养方法培养基是微生物生长的基础，在三抱布拉氏霉菌(B. trispora)(+)NRRL 2895和(一)NRRL 2896的培养过程中加入醋酸维生素A 1000mg/L,在摇瓶中培养使番茄红素的产量达(775 5)mg/L。北京化工大学在摇瓶中对三抱布拉氏霉菌(B. trispora)(+)ATCC 1427l和 (一) ATCC 14272的培养方法进行改进及优化，提出将混合好的正、负菌株的孢子悬液直接接种到发酵培 养基的一级培养工艺，发酵120 h后番茄红素的产量达314mg/L，使番茄红素的产量比传统工 艺提高了34。而尽可能地利用成分简单且价格低廉的培养基向来是发酵工程的宗旨，尤其 是利用生物质原材料，这就涉及到原材料的选择及处理问题。此外，由于三孢布拉氏霉菌 (B. trispora)在发酵过程中进行接合生殖，在发酵培养过程中正负菌株的接种种龄及混合配 比也显得尤为重要。这也是提高三孢布拉氏霉菌生产番茄红素能力的重要途径。2.2.2生物合成代谢调控由番茄红素的合成途径(图I)可知，法尼酯焦磷酸是类胡萝卜素的前体物质。同时，它也 是萜类的前体物质，为增强番茄红素的这一代谢流，就必需减弱或切断流向萜类的代谢流。 在三抱布拉氏霉菌(B. trispora)(+)ATCC 14271, (一)ATCC 14272发酵过程中报道添加麦角 甾醇抑制剂可以抑制麦角甾醇的合成从而使代谢流流向合成番茄红素的代谢流。结果显示， 在摇瓶中培养到第48h时添加酮康唑30mg / L,番茄红素含量达5.73 mg / g,比出发菌株提 高了 277%，产量达358.1 mg/L。番茄红素经番茄红素环化酶作用合成B-胡萝卜素(图1), 要使更多的代谢流流向番茄红素，则需抑制番茄红素环化酶的活性，阻断或削弱流向B-胡罗卜素的代谢流，达到积累番茄红素的目的。Hsu等考察了 2(4 氯苯基硫代)三乙胺氢氯化物 (CP. TA)和二苯胺(DPA)作为环化酶抑制剂对于三抱布拉氏霉菌(B. trispora)(+)NRRL 2456 和(一 )NR-RL 2457合成类胡萝卜素的影响，在摇瓶中培养结果显示，添加CPTA(35 mg/L)、 DPA(0. 1 mmol / L)后番茄红素的含量达1. 89 mg/g。此外，三抱布拉氏霉菌混合发酵过程 中产生三孢酸，三孢酸能刺激类胡萝卜素的大量合成。北京化工大学的研究人员在摇瓶中研 究发现三抱酸结构类似物a -紫罗酮、B紫罗酮和脱落酸作为前体对三抱布拉氏霉菌 (B. trispora)为(+)ATCC 14271，(一)ATCC 14272的生长及番茄红素合成有显著影响，结果 显示发酵2d后添加脱落酸9. 36X10-3mmol/L，番茄红素含量10. 24mg / g，产量达549mg /L。生物合成代谢调控成为发酵法生产番茄红素的研究热点，而目前主要集中在研究流向B- 胡罗卜素的代谢流，通过阻断或削弱流向B-胡罗卜素的代谢流来积累番茄红素；对于如何更 好的协同切断代谢支流，增强目的代谢流，以及如何从三孢布拉氏霉菌发酵进行独特的接合 生殖方式出发，有效补充前体物质从而大量合成番茄红素将是潜在研究方向。2.3番茄红素的分离纯化发酵法生产番茄红素的过程中，番茄红素在胞内大量积累，因此必须从细胞中抽提出番 茄红素。目前从细胞中提取番茄红素的方法主要有化学法，包括溶剂提取法和超临界萃取法 以溶剂提取法应用最多。番茄红素是一种脂溶性不饱和烃类化合物，可溶于乙醚、石油醚， 易溶于氯仿、苯、二硫化碳等有机溶剂。一般工艺为：番茄皮经过干燥后用有机溶剂提取； 滤渣用有机溶剂进行二次浸提；滤液部分浓缩后成为粗产品，精制可得番茄红素。研究将微 波法与有机溶剂提取结合使用，如Zhang等 使用微波辅助提取番茄红素，番茄红素的得率最 高97.4%。超临界萃取工艺简单，能耗低，萃取剂便宜，无毒易回收，可低温处理，适于番 茄红素等热敏性成分的优点。Topa 1等从番茄皮中提取番茄红素，通过改变压力、温度 及CO2的流速来获得的得率最大为118 mg/100 g。此外由于番茄红素分子结构的高度不饱和性，使其特别容易被氧化。在分离纯化的过程 中如何保证它的稳定性也是生产过程中亟待解决的难点。3市场前景 番茄红素具有预防癌症、防治心血管疾病、缓解骨质疏松症等多种生理功能，其独特的 功能使它的医药市场广大，国际市场上已有番茄红素的制剂品种(片剂、口服液、粉剂)。1990 年代以来，国际市场销售额以年均6%左右的速度递增。2003年，番茄红素欧洲市场值为3400 万美元，增长率10% ；数量为6.21,增长率12. 2%。预计到2010年，番茄红素的欧洲市场 将达到6 040万美元，复合年增长率为8. 4% ；数量为12.2 1,复合年增长率为10.3%，市 场前景广阔。2003年，我国番茄红素年生产能力不足51,市场需求量约4080t/a,市场售价200万 元/t。目前，我国每年大约有150万癌症患者，治疗癌症的番茄红素药物具有广大市场，此 外亚健康人员更是番茄红素产品的消费群体。随着临床消耗量的增加及不断发掘新的用途， 番茄红素的市场价格还将会呈上升趋势。然而我国番茄红素的研究和生产均处于起步阶段， 目前国内没有关于大规模发酵法生产番茄红素的文献报道，仅有几家公司和科研院所正在研 究发酵法生产番茄红素的小试工艺，因而需大力开展发酵法大规模生产番茄红素的研究。 4总结与展望目前以三孢布拉氏霉菌生产番茄红素的能力最为突出，(1)采用常规诱变技术对野生三孢 布拉氏霉菌(B. trispora):菌株(+)F986和菌株(一)F921进行突变改良，使番茄红素的含量 达15 mg/g。这是目前文献报道中以三抱布拉氏霉菌生产番茄红素的最高含量。(2)在三抱布 拉氏霉菌(B.rispora)(+)NRRL 2895和(一)NRRL 2896的摇瓶发酵过程中，在起始加入维生 素A醋酸盐1000 mg/L，番茄红素的产量达(7755)mg/L。这是目前文献报道的最高产量。(3) 在下游的分离纯化过程中，使用微波辅助溶剂提取番茄红素，得率最高为974。由于 番茄红素具有多种重要的生理功能，番茄红素在医药工业中的应用日益广泛，市场需求日渐 增大。而目前发酵法生产番茄红素的研究多集中在实验室规模，且对整个番茄红素的发酵过 程控制和代谢调控的研究还相对较少，对影响番茄红素产量、生产效率和工业化放大的探讨 还没有跟进，因此应对以下几个方面的问题进行深人研究：(1)番茄红素生产菌株的选育；(2) 生物合成代谢途径的调控；(3)发酵过程耦合强化及集成；(4)发酵过程中多层次、多水平的 系统生物学研究。参考文献1 Mehta BJ，Obraztsova IN，Cerda-Olmedo EMutantand intersexual heterokaryons of Blakeslea tr Dora for productionof BCarotene and lycopeneJApplEnvironMicrobial，2003，69(7)：4 0434 048s2 Alper H， MiyaokuK， Stephanopoulos GConstruction oflycopene-overproducingEcolistrains by combining systematicand combinatorial gene knockout targetsJNatBiotechnol，2005b，23：6126163 YoonSH，LeeYM，KimJE，eta1EnhancedlyeopeneproductioninEscherichiacoliengineered to synthesize iso pentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate frommevalonateJBiotechnol Bioeng，2006，94(6)：1 025 1 O324 李卓才，鲁波，尹红，等.番茄红素化学合成的研究进展J.合成化学，2006, 14(2)： 1l81215 王航，袁其朋，张黛黛发酵法生产番茄红素培养方法的改进及优化J.北京化工大学 学报，2006，33(6)：3841.6 徐军伟，徐芳，袁其朋.三抱酸结构类似物对发酵生产番茄红素的影响J.北京化工大 学学报，2007，34(2)：134137，7 ZhangLF，LiuZL. 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