荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

FISH 实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达 12000r/min咼压灭菌锅：160C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅 照相机(与荧光显微镜配套)：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、02mol/L (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB)试剂为 NaH2P04 2H20 和 Na2HP04 12巧0。-0. 2M 的 NaH2P04 溶液:31.2g NaH2P04 2H20,加蒸馏水 1000mL 溶解-0. 2M 的 Na2HP04溶液:71.632g Na2HP04 12H2O 加蒸馏水至 1000ml 溶解0. 2M (pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB) : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混 合咼压灭菌，常温保存。2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液(PBS)试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB0.03MPBS溶液：22.8gNaCI , 150ml磷酸缓冲溶液(PB)，加蒸馏水至1000ml,混匀 0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml 0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml 咼压灭菌，常温保存。3、4%多聚甲醛溶液(1000ml)(在通风橱内进行操作)-一将略小于2/3体积的水(660ml)加热到50C,40g多聚甲醛PFA,边搅拌边加入到水中，继续保持60C1 滴 2mol/LNaOH 溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。1/3 体积的 PBS 溶液，用Hcl将pH调至7.2，定容，用孔径为0.22卩m的滤膜过滤，一4C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20 Co(加热时温度不宜过高，为60C-65C，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否 则固定效果较差)。4、1mol/L(pH8.0)Tris-HCl 缓冲液的配置-121.1g Tris(三羟基氨基甲烷)，加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl-用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至8.0，最后加蒸馏水至1000Ml 高压灭菌，4C冰箱保存。5、10%SDS-10g SDS (十二烷基硫酸钠)于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌， 或用滤膜过滤称取SDS时需戴口罩！6、05M EDTA(pH80)溶液的配置一 186.1g乙二胺四乙酸二钠 加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌（最好使用磁力搅拌机） -用 NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。7、杂交缓冲液配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：360uL5M NaCl；40uL1MTrisHClxuL100甲酰胺（见下表）yuL无菌水（见下表）2uL10SDS0.22 um孔径的滤膜过滤，4C保存。表 1 配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积甲酰胺浓度（%）甲酰胺体积x（UL）无菌水体积y （uL）0510152015981498139812981198010020030040025500109830600998357008984080079845900698501000598551100498（甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度 （%）5M NaCI溶液 (mL)1M Tris-HCl(mL)10% SDS(mL)甲酰胺体积x（mL）无菌水体积y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下：Z uL 5M NaCl1mL 1MTris-HCl（pH7.6）无菌水加至 50mL50uL 10SDS500uL EDTA表2根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCI体积数3011201123580080405605620225022525159015950280285520020454004010159000640046003280900640460328不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度 （%）IM Tris-HCl(mL)10% SDS(mL)0.5M EDTA(mL)5M NaC 1溶液(mL)尢菌水体枳（mL）2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4,6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid （DAPI）常备：1 mg M-i需要稀释为：1 Ag M-i灭菌储存在-20C （用铝箔覆盖管子）DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。三、实验步骤：1、玻片的预处理：（1）玻片预处理1）玻片清洗： 载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗（45 次 每次10 min）,然后用清水浸泡过夜；2）硅化处理：第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌, 60 C烘干。盖玻片用锡纸包好T C保存备用。（盖玻片干净即可，不用处理）（2）黏附剂涂片制备载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约1min,取出用高压灭菌处理 过的蒸馏水清洗后于室温下干燥（也可放入烘箱里25 C烘干），然后置4C保存备用2、荧光探针的选择和标记（见 fish 探针的选择表）3、样品的制备与固定（1）用已灭菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液1mL,加适量灭菌蒸馏水振荡混匀， 并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约 0.5ml 进行后续处理。（2）将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4C固定24小时，（3）然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入1ml 0.0Imol/L PBS以 10000r/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。（4）采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20C保存备用4、样品的预处理（1）用微型振荡器将样品混合均匀，取10山样品在载玻片上涂抹20mmx20mm大小（不要 太大），37C的烘箱热固定2h,最高温度不超过60C（2）风干后于50%、80%、95%的乙醇中各脱水3min，自然风干。（脱水：准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中用，50%乙醇淹没载玻片， 脱水3min，取岀放入第二、三个瓷盘,然后用80%乙醇脱水,96%乙醇脱水。脱水后的80%、 96%乙醇回收。）脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-20C的条件下保存几个月5、原位杂交探针浓度为50ng/,在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压灭菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一 定的湿度。用移液枪分别取24的杂交液和1探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖 涂片面积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如 下。所有有关探针的操作在处理时都应避光处理！探针种类温度（C）时间（h）甲酰胺浓度备注EUB MIX46520同步染色法AOB MIX46355重复染色法NOB MIX46540重复染色法GAO MIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、杂交后洗涤从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48C的水浴中预热20分钟。杂交 完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特 异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗1520分钟后取出，用 清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。7、DAPI染色每个玻片用10L DAPI（用甲醇稀释至1Ug/M）滴加到载玻片样品上，在冰上染色10min， 用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。8、荧光显微镜观察经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度 修饰探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰EUB338Domain BacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizing bacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite-oxidizing bacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPAO651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：a探针浓度均为50ng/pL； bcNIT3为硝酸菌探针NIT3的竞争探针。Abbreviationmaximum absorptionMaximum emissionFilter setFITC (绿色)492nm528nm10(Zeiss)DAPI （蓝色）365 nm418 nm02(Zeiss)CY3 （橙色/红色）554 nm570 nm15(Zeiss)CY5 （红外线检测）650 nm667 nm26(Zeiss)HEX探针的选用选用EUB MIX（EUB338、EUB338II、EUB338III）来检测活性污泥中的全部的细菌。选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，选用AOB MIX NOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria，用 PAO651 来检测优势菌种 Rhodocyclus，杂交后用 4C ,6-diamidino-2-phenylindole dihydro-chloride （DAPI） （1:1,000 稀释）和 PHB 进行 复染样品。试剂与材料：NaH2P04 2H20，Na2HP04 12H2O；NaCl；多聚甲醛 PFA；150g三羟基氨基甲烷（Tris），浓HCl，NaOH；十二烷基硫酸钠（SDS）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；100甲酰胺；DAPI；载玻片，盖玻片，吸水纸，瓷盘（带盖）；