生物大分子分离纯化-原理与技术

1 2023-1-10生物大分子分离纯化生物大分子分离纯化原理与技术原理与技术 2 2023-1-10内容提要内容提要1、层析原理与技术、层析原理与技术2、凝胶过滤层析、凝胶过滤层析3、UNOsphere离子交换分离技术离子交换分离技术4、CHT陶瓷羟基磷灰石分离技术陶瓷羟基磷灰石分离技术5、疏水相互作用与亲和层析、疏水相互作用与亲和层析 3 2023-1-10Life is based on proteins and their interactions 4 2023-1-10 5 2023-1-10 层析的起源和原理层析的起源和原理 起源-1906年，俄国植物学家Tsweet 原理-利用物质分配系数不同达到分离 目的0.050.0100.0%Buffer B-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.4500.50000:00:0001:00:0002:00:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU原理与操作原理与操作Chromatography层析层析色谱色谱 6 2023-1-10什么是生物层析什么是生物层析 根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ionic characteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离原理与操作原理与操作 7 2023-1-10GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换Hydrophobic Interaction疏水层析反相Affinity亲和层析 CHT羟基磷灰石原理与操作原理与操作 8 2023-1-10 最广泛的蛋白质分离纯化方法最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质空间结构与活性 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离层析原理与操作层析原理与操作 9 2023-1-10层析的层析的5个操作步骤个操作步骤 装柱并平衡装柱并平衡 上样上样 平衡平衡 洗脱洗脱 再生再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作原理与操作 10 2023-1-10层析图层析图原理与操作原理与操作第一峰第一峰,外水体积外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量蛋白质含量(A280),由由UV检测器读出，检测器读出，y轴轴基线基线洗脱峰，有些可以很好的分离，洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉有些分得不是很好，有部分交叉有时这里也显示梯有时这里也显示梯度浓度等检测值度浓度等检测值时间或体积，时间或体积，x轴轴 11 2023-1-10纯化平台的硬件结构纯化平台的硬件结构 层析工作站 层析介质和层析柱原理与操作原理与操作 12 2023-1-10层析系统层析系统DuoFlow中高压层析系统中高压层析系统LP低压层析系统低压层析系统Profinia全自动亲和全自动亲和层析系统层析系统手动层析组件手动层析组件 13 2023-1-10DuoFlow中高压层析系统中高压层析系统主要特点：主要特点：1.3500psi高压力下梯度模式最大流速可达20ml/min2.连续波长，4波长同步检测3.方形X、Y轴组分收集器4.软件直观容易使用 14 2023-1-10BioLogic LP 低压层析系统低压层析系统LP Data View 软件软件BioLogic LP 系统BioFrac 方形方形组分收集器组分收集器主要特点：主要特点：1.流速精确，0.01ml/min2.检测灵敏度更高,0.001AU3.兼容方形收集器 15 2023-1-10Profinia 蛋白质纯化系统蛋白质纯化系统主要特点：主要特点：1.全自动亲和纯化，包括亲和标签、亲和无标签，抗体等纯化2.双紫外检测器设计3.纯化与脱盐串联一步完成4.结果直接报告目标蛋白的浓度和得率 16 2023-1-10为什么在层析技术中要使用层析仪为什么在层析技术中要使用层析仪 介质的要求 实验的精密度和重现性要求 时间的要求 17 2023-1-10纯化平台的硬件结构纯化平台的硬件结构层析介质与层析柱，原理与技术层析介质与层析柱，原理与技术 18 2023-1-10层析介质层析介质离子交换层析介质离子交换层析介质 Unosphere Q，S MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM亲和层析亲和层析 Profinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A,Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质 Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化介质凝胶过滤层析介质凝胶过滤层析介质 Bio-Gel P系列 Bio-Beads S-X介质羟基磷灰石介质（羟基磷灰石介质（CHT）氟代羟基磷灰石介质（氟代羟基磷灰石介质（CFT）疏水层析介质疏水层析介质 Macro-Prep Methyl HIC Macro-Prep t-Butyl HIC Bio-Beads SM-2吸附剂 19 2023-1-10层析柱层析柱分析柱分析柱 离子交换分析柱：Uno Q,S Aminex分析柱分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子 羟基磷灰石分析柱：Bio-Scale CHT-I 凝胶过滤分析柱：Bio-Sil,Bio-Silect HPLC 分析柱 反相层析分析柱：Hi-Pore RP304,Hi-Pore RP318各种层析介质的各种层析介质的Cartridges用于条件摸索用于条件摸索 UNOsphere MacroPrep CHT HIC 20 2023-1-10层析介质结构原理层析介质结构原理UnosphereMacroPrep离子交换层析Q，S，DEAE，CM疏水层析-CH3,t-Butyl亲和层析Protein AIDANi多粘菌素凝胶过滤凝胶过滤CHT和和CFTUnosphere Q,SMacroPrep High Q,SMacroPrep DEAE,CMMacroPrep Methyl HICMacroPrep t-Butyl HICProfinity IMACProfinity EpoxideAffi-Gel Protein A,Affi-Prep Protein AAffi-Gel,DEAE,CMAffi-Prep PolymixinAffi-Gel硼胶Affi-Gel配体固定化活化 21 2023-1-10凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析疏水层析疏水层析亲和层析亲和层析 22 2023-1-101.Spherical particles packed into a column2.Sample applied3.Buffer mobile phase and sample move through column,molecules diffuse in and out of matrix4.large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size,molecules larger than the matrix pores pass straight through.DiffusionBufferDiffusion into the poresDiffusion out of the poresBuffer凝胶过滤凝胶过滤 23 2023-1-10凝胶过滤层析凝胶过滤层析分离纯化原理分离纯化原理 24 2023-1-10A good gel for gel filtration contains about95%water凝胶结构凝胶结构 25 2023-1-10Steric exclusion leads to early elution 按照分子量大小洗脱按照分子量大小洗脱 大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱 26 2023-1-10 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2Bio-Gel P4Bio-Gel P6Bio-Gel P10Bio-Gel P30Bio-Gel P60Bio-Gel P1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶的选择凝胶的选择 27 2023-1-10Bio-Gel P4(800-4,000)for separation digested products from IgG凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶的选择凝胶的选择 28 2023-1-10凝胶过滤层析凝胶过滤层析Bio-Gel P6(1000-6000)凝胶的选择凝胶的选择 29 2023-1-10凝胶过滤层析凝胶过滤层析Bio-Gel P10(1500-20,000)凝胶的选择凝胶的选择 30 2023-1-10凝胶过滤层析凝胶过滤层析Bio-Scale Mini Bio-Gel P6脱盐预装柱脱盐预装柱操作方便，可连接在DuoFlow、LP、Profinia和Econo泵上 31 2023-1-10Bio-Beads S-X介质介质 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体Bio-Beads S-X1Bio-Beads S-X3600 Bio-Beads S-X81,000 Bio-Beads S-X12400 高分辨率亲脂性分子排阻色谱高分辨率亲脂性分子排阻色谱2,000 14,000 中草药和天然产物活性成分分离纯化中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、杂环化合物杂环化合物介质可兼容苯、甲苯、二甲介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂苯、全氯乙烯等有机溶剂凝胶过滤层析凝胶过滤层析 32 2023-1-101、三硬脂酸甘油酯，、三硬脂酸甘油酯，8912、三肉豆蔻酸甘油酯，、三肉豆蔻酸甘油酯，7293、三月桂酸甘油酯，、三月桂酸甘油酯，6454、三辛酸甘油酯，、三辛酸甘油酯，4775、三己酸甘油酯，、三己酸甘油酯，3936、十六烷，、十六烷，2267、十一烷，、十一烷，156Bio-Beads S-X8分离效果分离效果高分辨率亲脂性分子排阻色谱高分辨率亲脂性分子排阻色谱Bio-Beads S-X介质介质凝胶过滤层析凝胶过滤层析 33 2023-1-10柱长的选择柱长的选择 分离：30120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液洗脱液 离子强度低高离子作用 排阻作用（0.1-0.5M)疏水作用 pH中性中性流速，流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量样品容量：13CV凝胶过滤层析凝胶过滤层析操作参数选择操作参数选择 34 2023-1-10增加分辨率的方法增加分辨率的方法检测柱效检测分离度 减少上样体积降低流速使用更小的介质颗粒的介质连接2根层析柱 35 2023-1-10 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用凝胶过滤层析的应用 36 2023-1-10凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点：凝胶过滤层析的特点：1.层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从而设备成本很高；2.上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；3.工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；4.分辨率低；5.不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子交换上样前的脱盐 37 2023-1-10cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quaternary amineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析离子交换层析类型及其选择离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-38 2023-1-10pIstability rangestability range与阳离子交换与阳离子交换介质结合介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析离子交换层析原理离子交换层析原理蛋白质滴定曲线蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷蛋白质净电荷与阴离子交换与阴离子交换介质结合介质结合 39 2023-1-10Products:UNOsphere Q&S,Macro-Prep High Q&S,CM,DEAE,AG resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration-+-+-+离子交换层析离子交换层析离子交换层析原理离子交换层析原理 40 2023-1-10sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+-anionexchangerbead离子交换过程离子交换过程 41 2023-1-10离子强度离子强度 洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与缓冲液与pH 选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上 阴离子通常高于pI一个pH单位以上 蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析离子交换层析操作参数选择离子交换层析操作参数选择 42 2023-1-10pI5.5+-pH102离子交换层析离子交换层析缓冲液与缓冲液与pHpI7.5阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷蛋白质净电荷pH4.0pH9.0蛋白质稳定性范围蛋白质稳定性范围 43 2023-1-10pH 7.0pH 8.0pH 8.9pH 6.0pH6.0pH7.0pH 8.0pH 8.9缓冲液与缓冲液与pH的影响的影响阴离子交换阴离子交换离子交换层析离子交换层析离子交换层析操作参数选择离子交换层析操作参数选择 44 2023-1-10离子交换层析离子交换层析离子交换层析操作参数选择离子交换层析操作参数选择盐溶液梯度的影响盐溶液梯度的影响 45 2023-1-10Columns MediaBio-Scale Mini High Q Macro-Prep high QBio-Scale Mini High DEAE Macro-Prep DEAEBio-Scale Mini High S Macro-Prep high SBio-Scale Mini UNOsphere Q Macro-Prep CMBio-Scale Mini UNOsphere S Macro-Prep 25 QBio-Scale Mini UNOsphere rapid S Macro-Prep 25 SUNO QUNOsphere QUNO SUNOsphere S UNOsphere rapid S 离子交换层析离子交换层析离子交换层析产品离子交换层析产品50um25um120um80um10um100um 46 2023-1-10 更高的选择性和更高的选择性和分辨率分辨率 10%穿透穿透载量载量:Unosphere Q:150 mg/ml BSA 600 cm/hr Unosphere S:30 mg/ml BIgG 600 cm/hr 高流速，低反压高流速，低反压 操作压力:1 week长期:Storage in 0.1 M NaOH RT for 1 year 生产效率大大提高生产效率大大提高离子交换层析离子交换层析UNOsphere Q/S性能参数性能参数 47 2023-1-10Column 1.1 x 20 cm Load buffer:20 mM Tris,pH 8.5Elution Buffer:Load+0.5 NaClLoad:5 mg/ml BSAColumn 1.1 x 20 cm Load buffer:20 mM NaAc,pH 5.0Elution Buffer:Load+0.5 NaClLoad:1.64 mg/ml hIgGUNOsphere Q:BSAUNOsphere S:HIgG 高流速，高载量：高流速，高载量：Unosphere 48 2023-1-10高流速，低反压：高流速，低反压：Unosphere05101520020040060080010001200Linear Velocity(cm/hr)Column Backpressure(psi)UNOsphere SUNOsphere Q 49 2023-1-10SupportLinear velocity(cm/hr)Recovery(%)BSA binding capacity(g/L)Process time(hr)Productivity(g/L/hr)UNOsphere Q6151001201.5875.0Q Sepharose FF30099.023.01.1919.0Fractogel EMD TMAE(M)10599.082.05.0416.0SupportLinear velocity(cm/hr)Recovery(%)Human IgG binding capacity(g/L)Process time(hr)Productivity(g/L/hr)UNOsphere S110098.632.00.6053.3SP Sepharose FF50097.814.30.7718.5Fractogel EMD SO3(M)23197.066.46.5010.2离子交换层析离子交换层析 50 2023-1-10UNOsphere 更高的生产效率：更高的生产效率：更短的工艺时间更短的工艺时间短时间内处理大量体积样品短时间内处理大量体积样品更小的层析柱，更少的介质更小的层析柱，更少的介质更高的产量更高的产量更短的生产周期更短的生产周期生产成本下降生产成本下降离子交换层析离子交换层析l 蛋白质纯化，特别是从原材料或发酵中蛋白质纯化，特别是从原材料或发酵中间体目标蛋白的大量捕获间体目标蛋白的大量捕获l 中间纯化中间纯化UNOsphere Q/S应用应用 51 2023-1-104 Process Steps1.Polymerization2.Washing3.Deagg/Sizing4.Base TreatmentMonomerCross-linkerIonomerSurfactantSaltSolventInitiatorHeatBase TreatmentBottlingIPA WashUnsized UNOsphere BeadWet SizingSized UNOsphere BeadDeaggUNOsphere 制造过程制造过程 52 2023-1-10UNOsphere%cross-linker:S25%Q25%离子交换层析离子交换层析UNOsphere Q/S结构结构 53 2023-1-10Q：(CH3)3N+S：SO3-Profinity IMAC：IDA-Ni，Cu，Co离子交换层析离子交换层析UNOsphere Q/S结构结构 54 2023-1-10Reference:T.Ogawa et.al.Hydroxyapatite Conference 2001陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术合成合成 55 2023-1-10 左边:Bio-Gel HT/HTP 羟基磷灰石 右边:CFT/CHTTM 陶瓷羟基磷灰石 I&II 晶体与陶瓷结构晶体与陶瓷结构陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 56 2023-1-10 Ca10(PO4)6(OH)2 5 个带正电荷的Ca离子对（C位点）2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）2 个羟基 于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构陶瓷羟基磷灰石晶体结构陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 57 2023-1-10产品类型与参数产品类型与参数陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 58 2023-1-10 蛋白质带正电氨基蛋白质带正电氨基 经典的阳离子交换经典的阳离子交换 用中性盐溶液用中性盐溶液(NaCl)或缓冲盐溶或缓冲盐溶液液(PO4)洗脱洗脱初级保留机制初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 59 2023-1-10 带负电羧基带负电羧基 经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节 比离子间静电相互作用强比离子间静电相互作用强1560倍倍 在无在无PO4 条件下不能被任何浓度条件下不能被任何浓度NaCl洗脱洗脱 用用PO4洗脱洗脱初级保留机制初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 60 2023-1-10 大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳亲和与阳离子交换离子交换 酸性蛋白质的结合，如白蛋白（酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。影响是非常有限的。碱性蛋白质，如碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著影响显著注：注：对于带负电荷的酸性蛋白质，无论样品是否含有NaCl，都对上样时的吸附载量和保留无影响，这意味着可以将捕获阶段获得的中间体样品无需脱盐处理即可上样到CHT上进行高分辨率中间纯化混合保留机制混合保留机制陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 61 2023-1-10Equlibrate:5mM NaPO4 pH 6.5Gradient:5mM300mM NaPO4Eq:5mM PO4,0.3M NaCl pH 6.5Grad:5mM300mM PO4,0.3M NaClIgG MAbBSA混合保留机制混合保留机制陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 62 2023-1-10 单克隆抗体，多克隆抗体纯化单克隆抗体，多克隆抗体纯化 重组疫苗重组疫苗 抗体片段抗体片段 重组蛋白质重组蛋白质 酶酶 核酸核酸:DNA/RNA(单双链单双链)膜蛋白质膜蛋白质羟基磷灰石应用羟基磷灰石应用陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 63 2023-1-10 优点优点 独特的分离机制 高再生能力 高分辨率 容易规模放大 容易进行方法开发 高机械稳定性 高化学稳定性 层析柱寿命长 易于将HT工艺直接转移到CHT/CFT上 CFT 比比CHT更耐酸更耐酸颗粒大小：颗粒大小：20um、40um和和80um陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 64 2023-1-10Type I由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.Type II由于具有大孔结构，II 型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备如何选择类型如何选择类型陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 65 2023-1-10CHT纯化或去除纯化或去除DNA的机理的机理陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 66 2023-1-10分离纯化原理与操作参数选择分离纯化原理与操作参数选择羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）影响蛋白质色谱行为的操作参数：影响蛋白质色谱行为的操作参数：CHT类型类型 NaCl浓度浓度 PB缓冲液浓度梯度缓冲液浓度梯度 双梯度洗脱双梯度洗脱 PB缓冲液梯度含不同缓冲液梯度含不同NaCl浓度浓度 缓冲液缓冲液pH值值双梯度洗脱模型双梯度洗脱模型先以先以0-500mM NaCl，再以再以0-500mM 磷酸钾磷酸钾 67 2023-1-10不同类型不同类型CHT陶瓷羟基磷灰石在不同陶瓷羟基磷灰石在不同pH下不同蛋白质的保留时间（下不同蛋白质的保留时间（min）羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）68 2023-1-10不同蛋白质分离纯化的不同蛋白质分离纯化的Protocol：IgG羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）69 2023-1-10不同蛋白质分离纯化的不同蛋白质分离纯化的Protocol：球形蛋白质，质粒球形蛋白质，质粒羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）70 2023-1-10不同蛋白质分离纯化的不同蛋白质分离纯化的Protocol：酸性蛋白质酸性蛋白质羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）71 2023-1-10双梯度洗脱双梯度洗脱羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）0-0.5MNaCl0-0.4MNaPO4玉米种子中纯化转基因抗体玉米种子中纯化转基因抗体IgG 72 2023-1-10图1 CHT-I柱纯化1-AT。柱尺寸：752mm(10ml)；上样量：5.0ml；Buffer A：10mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；Buffer B：400mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；梯度：0-5%B和5-30%B各5个柱体积，30-100%B 10个柱体积；流速：2.5 ml/min。分部收集组分为1.5ml，收集如下：收集组分I-VIII分别为：运行组分（图上方轴）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、69-71和74-77。绿条框指示为1-AT洗脱液。CHT纯化转基因羊奶中的重组人纯化转基因羊奶中的重组人1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 羟基磷灰石（羟基磷灰石（CHT）PI其中，其中，1-AT，pI5.27 乳白蛋白，乳白蛋白，pI5.16 -乳球蛋白乳球蛋白,pI=4.775.274.775.16 73 2023-1-10Market trend of therapeutic antibodiesTwenty approved antibody therapeutics currently available for the treatment of various diseases-Reopro,Rituxan,Herceptin,Remicade,Synagis,Avastin,Erbitux,Xolair,Raptiva,Lucentis,Tysabri,etc.The antibody therapeutics market is expected to grow by about 30%annually reaching excess of$22 billion by 2007.Reference:Antibody Therapeutics:Protein Development,Market Trends,and Strategic Issues,Revised edition http:/ 74 2023-1-10Production of MonoclonalsFermentationHarvestRecoveryDownstreamProcessingBulk DrugSubstance 75 2023-1-10Monoclonals Downstream Process A Generic ApproachSerum freeconditioned mediacontaining cellsHarvest by TFF orcentrifugationCaptureChromatographyVirus inactivationPurificationChromatographyFiltration(Virus removal)PolishingChromatographyUF/DF to formulateBulk DrugSubstance 76 2023-1-10Critical contaminants in downstream process developmentContaminantsMolecular weightsIsoelectric pointsIgG Aggregates300,000Same as IgGProtein A42,0004.9-5.1DNA1,000-1,000,000Highly acidicEndotoxin100,000Highly acidicHost cell proteinsVaryVariousViruses1,000,0003322 90 2023-1-10Retention of endotoxins Endotoxins are highly acidic due to a high content of phosphoryl and carboxyl residues.Both should have strong affinity for CHT calcium.Elution in the absence of phosphate should not occur.Some endotoxins have amino groups which may cation exchange with CHT phosphates at low ionic strength.Endotoxins occur in a range of aggregation states,into the millions of Daltons.Most of the charges are internalized because of their association with the hydrophobic lipid A region.Both size and charge shielding may affect retention.Endotoxins are frequently complexed with proteins and other cell wall components that may also influence retention 91 2023-1-10IgG zoneIgG zoneNaCl 0-1.5MClean with 0.5M PO4PO4 0-0.3MClean with 0.5M PO4Affinity of endotoxins to CHTLPS mixture from E.Coli,Salmonella and Pseudomonas CHT type I,40 micron,300 cm/hr 92 2023-1-10Removal of host cell proteins(HCP)HCP are unique for each cell line.Hundreds to thousands of HCPs derived from cell or cell debris are present in fermentor fluid.Bulk of HCPs is removed across protein A chromatography.Mixed mode interaction with CHT can offer unique opportunity for removal of residual HCPs.93 2023-1-10The effect of NaCl and phosphate on CHOP clearance CHO protein(ppm)Protein A eluate58.3NaCl gradient pool40 1Protein A ng -162 6DNA ng 9.9x105 3.8x104 12Endotoxin EU 2.6x103 5.0 x102 3 logs reduction by PCR reduced to Cl-Br-NO3-ClO4-I-SCN-Cations:Mg2+Li+Na+K+NH4+蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱原理原理疏水层析疏水层析MacroPrep Methyl HICMacroPrep t-Butyl HIC产品产品 101 2023-1-10疏水层析疏水层析生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析 步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术比反相层析的配体密度低很多，无须有机溶剂洗脱，保存生物活性配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质 102 2023-1-10作用原理作用原理溶质曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG=DH-T DS 103 2023-1-10为什么使用疏水层析为什么使用疏水层析?离子交换技术、羟基磷灰石、凝胶过滤技术、亲和层析技术的补充离子交换技术、羟基磷灰石、凝胶过滤技术、亲和层析技术的补充温和，非变性条件纯化温和，非变性条件纯化互补的选择性互补的选择性高收率高收率浓缩技术浓缩技术 104 2023-1-10操作参数选择操作参数选择疏水层析疏水层析疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性强的蛋白质：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和缓冲体系和pH洗脱梯度洗脱梯度 105 2023-1-10Sample:GFP sample brought up to 2 M AS,filteredLoad:5 mlBuffer:A:2 M(NH4)2SO4+0.1 M NaP,pH 7B:0.1 M NaP,pH 7Flow Rate:3 ml/min(230 cm/hr)0.025.050.075.0100.0%Buffer B12345678910111213141516171819202122-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.20000:00:0000:10:0000:20:0000:30:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU0.025.050.075.0100.0%Buffer B19:16.8123456789101112131415161718-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.20000:00:0000:10:0000:20:0000:30:00FractionsHr:Min:SecVoltsAUMacro-Prep 甲基疏水甲基疏水苯基疏水苯基疏水20%EtOH疏水层析疏水层析 106 2023-1-10Profinity IMAC纯化His-tagged ProteinChelex 100纯化DNA，PCR样品制备Affi-Gel Protein A纯化单克隆抗体Dye-Affi-Gel Blue(DEAE or CM)纯化单抗，分离HSAAffi-Gel 肝素凝胶肝素凝胶多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-Gel Polymixin去除内毒素（热原）Affi-Gel 硼胶硼胶分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子亲和层析亲和层析产品与应用产品与应用 107 2023-1-101.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionEquilibrate the column and the sample to binding conditions.MatrixSpecific ligand亲和层析亲和层析 108 2023-1-10亲和层析亲和层析1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionTarget bindsOthers wash outApply sample under binding conditions.109 2023-1-10亲和层析亲和层析1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionTarget elutesChange the eluent to elute the target.110 2023-1-10Profinity IMAC Resins固定化金属螯合层析：Immobilized Metal Affinity Chromatography（IMAC）基于纯化重组组氨酸标记蛋白设计，专门纯化His-tagged Protein 螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+,现有的产品为螯合Ni2+的介质 UNOsphere 技术技术 更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。IDA 111 2023-1-10各种流速下的载量和分辨率高流速，高载量，高分辨率，高流速，高载量，高分辨率，低反压低反压Profinity IMAC Resins高流速、低反压 112 2023-1-10不同 IMAC 介质纯化氨基肽酶(aminopeptidase)纯度比较Profinity IMAC,IDA ligandProfinity IMAC Resins 113 2023-1-10使用DuoFlow系统进行Profinity IMAC循环性能研究1.Strip 50mM EDTA,50mM sodium phosphate,300mM NaCl(pH7.5)2.Clean 50mM sodium acetate,300mM NaCl(pH4.0)3.Charge 100mM NiSO4(pH4.0)4.Clean 50mM sodium acetate,300mM NaCl(pH4.0)5.Equilibrate 50mM sodium phosphate,300mM NaCl(pH8.0)6.Sanitize 1.0N NaOH7.Sample E.coli.lysate containing 3.51mg of 75kD r-His-tagged protein1mL Profinity IMAC柱 201次循环实验Profinity IMAC Resins 114 2023-1-10Profinity IMAC Resins 纯化 6His-tagged proteinSample：E.coli.lysate96%纯度Profinity IMAC Resins 115 2023-1-10联系方式：联系方式：沈志扬沈志扬Email：zhiyang_shenbio-电话：电话：021-64260808-51移动电话：移动电话：13918947931