淀粉酶活性测定实验报告

班级：植物092:X 炜佳学号：0901080223淀粉酶活性的测定一、研究背景及目的酶是高效催化有机体新陈代谢各步反响的活性蛋白，几乎所有的生化反响都离不开酶 的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。 酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的根底。酶活 力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为a- 淀粉酶和卩-淀粉酶等。a-淀粉酶和卩-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。卩 -淀粉酶存在于休眠的种子中，而a-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。a-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,a -淀粉酶活性低的品种抗穗发芽，反之 那么易穗发芽。目前，关于a-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不一样，国内 外测定a-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这 3种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的a-淀粉酶活性应该分别是延迟 （内源）a-淀粉酶、萌动种子a-淀粉酶和后熟面粉的a-淀粉酶活性。测定方法优点缺点DNS灵敏、准确、准确度高,适宜准 确测量小样品a-淀粉酶活性 大小测定步骤较繁，不便分析大量 样品,测定范围较窄凝胶扩散法简便、快速、省时、省力，消耗 材料和药品较少，不需要特殊 仪器,测定范围较宽边界不清晰，灵敏度与准确度 较低，不适宜准确测量a-淀粉 酶活性的大小降落值法快速、省时、重现性好、平行 性好、消耗的药品少，适宜于测 量大量样品消耗的材料多，间接测定a-淀 粉酶活性大小本实验的目的在于掌握a-淀粉酶和卩-淀粉酶的提取和测定方法。二、实验原理萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是a-淀粉酶和卩-淀粉酶，卩-淀粉酶不耐热，在高温 下易钝化，而a-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下那么发生钝化。本实验的设计利用彷淀粉酶不耐 热的特性，在高温下70C丨下处理使得卩-淀粉酶钝化而测定a-淀粉酶的酶活性。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的， 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者复原 生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含 量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得 两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反响引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实 验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管 及空白管不要混淆。三、材料、试剂与仪器实验材料：萌发的小麦种子芽长1 厘米左右 仪器：722光栅分光光度计（编号 990695）DK-S24型电热恒温水浴锅（编号L-304056）离心机（TDL-40B）容量瓶：50mlX1, 100mlX1小台秤 研钵具塞刻度试管：15ml X 6试管：8 支移液器烧杯试剂： 1%淀粉溶液称取1克可溶性淀粉，参加80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml; pH5.6的柠檬缓冲液：A液称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1LB液称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液； 3, 5-二硝基水杨酸溶液称取3, 5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中， 参加50ml蒸馏水，再参加30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保 存； 麦芽糖标准液称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容； 0.4M NaOH四、实验步骤1. 酶液的制备称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆，转移到50ml容量瓶 中用蒸馏水定容至刻度,混匀后在室温下放置,每隔数分钟振荡一次,提取1 5-20分钟,于 3500转/别离心 20分钟,取上清液备用。2. a-淀粉酶活性的测定 取 4 支管,注明2 支为对照管,另2 支为测定管 于每管中各加酶提取液液1ml，在70C恒温水浴中水浴温度的变化不应超过士0.5C准确加热15min，在此期间卩-淀粉酶钝化，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。 在试管中各参加1ml柠檬酸缓冲液 向两支对照管中各参加4ml 0.4M NaO H,以钝化酶的活性 将测定管和对照管置于40C0.5C恒温水浴中准确保温15min再向各管分别参 加40C下预热的淀粉溶液2ml,摇匀，立即放入40C水浴中准确保温5min后取出，向两支 测定管分别迅速参加4ml 0.4M NaOH,以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。3. 两种淀粉酶总活性的测定取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度稀释倍数视样品酶活性大小而定, 一般为 20 倍。混合均匀后，取 4 支管，注明 2 支为对照管，另 2 支为测定管，各管参加 1ml稀释后的酶液及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml,以下步骤重复a-淀粉酶测定的第及第的 操作。4. 麦芽糖的测定标准曲线的制作取15ml具塞试管7支，编号，分别参加麦芽糖标准液1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、 0.9、1.0毫升，用蒸馏水补充至1.0ml，摇匀后再参加3, 5-二硝基水杨酸1ml,摇匀，沸水 浴中准确保温5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于520nm波长 下比色,记录消光值,以消光值为纵坐标,以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 样品的测定取15ml具塞试管8支，编号，分别参加步骤2和3中各管的溶液各1ml,再参加3, 5-二硝 基水杨酸1ml,摇匀，沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后 用分光光度计于520nm波长下比色，记录消光值，根据标准曲线进展结果计算。五、数据整理及计算-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）=（AA ）x样品稀释总体积样品重（g）x5（a-+卩-）淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-i鲜重分钟-1）=（B B）x样品稀释总体积样品重（g）x5麦芽糖标准液 浓度mg/ml00.10.30.50.70.91.0OD520工程a（测）a（测）a（对）a（对）a+卩（测）a+卩（测）a+p（对）a+p（对）OD520平行组数据均 值OD520样品麦芽糖浓 度 mg/ml上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线见下页,计算上 表中第4行数据各样品的OD值均值，填入上第5行中，根据标准曲线的方程，计算第 5 行 OD 值所对应的麦芽糖浓度,填入最后一行,如上表。 根据以上的数据整理的结果,结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：Aa-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A a-淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度B（a-+p-）淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B （a-+p-）淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度计算结果如下：a-淀粉酶活性=毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1(a-+p-)淀粉酶活性=毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1 卩-淀粉酶活性=毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1六、结果分析七、思考题1、酶活力测定实验的总体设计思路是什么？实验设计的关键你认为是什么？为什么？ 答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶活性，通过测酶促反响 的产率推算酶活力大小。关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或防止其它酶产物给测定结果带 来的误差。2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是哪些步骤？为什么？怎样的操作策略可 以尽量减少误差？答：浸提步骤。70C温度或15min时间控制不严格不准确那么可能导致卩淀粉酶未完全钝 化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。70C水浴后需要立即冰浴，否那么卩淀粉酶 复性使测得a淀粉酶活性结果偏大。向测定管中参加NaOH时应迅速，否那么酶与底物继 续反响使结果偏大。3、a-淀粉酶活性测定时70C水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤 冷？答：由于卩-淀粉酶不耐热，在70C下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以到达理 想的钝化效果，时间过长，a-淀粉酶活性也会受到影响；时间缺乏，卩-淀粉酶钝化不完全。 保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变卜淀粉酶的构造以防止在随后的反响中复性，这 样就保证了在随后的40C温浴的酶促反响中卩-淀粉酶不会再参与催化反响。此外我认为冰浴 使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。4、pH5.6柠檬酸缓冲液的作用？各管于40C水浴准确保温15分钟的作用？答：酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。参加pH5.6的缓 冲液调至酶促反响的最适pH,同时稳定溶液的pH不至于在反响过程中大幅波动。40C水浴准确保温15分钟为调整酶促反响的最适温度5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化B -淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总 酶活力的策略，为何不采取钝化a-淀粉酶活力去测卜淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什 么？答：P淀粉酶与a淀粉酶的催化特性是有差异的。卩淀粉酶主要作用于直链淀粉的a-1, 4-糖苷 键，而且仅从淀粉分子外围的非复原性末端开场，切断至a-1,6-键的前面反响就停顿了；而a 淀粉酶那么无差异地作用于直链淀粉与支链淀粉的a-1, 4-糖苷键，所以卩淀粉酶需要a淀粉酶 淀粉支链的a-1, 4-糖苷键后才能完全表达其催化能力。此外我认为在实验中温度比酸度更易控制，钝化a淀粉酶难度远远高于卩淀粉酶，而且假设提 高酸度钝化a淀粉酶，那么回调最适pH时a淀粉酶也有可能由于复性恢复活力。 这种设计思路说明在测定酶的比活力时要综合考虑各种可能出现的酶的性质以及它们之间 的联系,也要考虑到实验操作的可行性。6、本实验中所设置的对照管的作用？它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异 同？本实验可否用对照管调分光光度计的100%T ?为什么？ 答：消除非酶促反响如淀粉酸性环境下加热水解和非测定时间内的酶促反响引起的麦芽 糖的生成带来的误差。两种都是为了消除非测定局部对光的吸收,空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的 吸收,而对照管是为了消除非测量所需反响所得的多余溶质对光的吸收。不可，因为标准曲线确实定是在空白的根底上的，得到的是OD值与麦芽糖含量的关系7、我们所测定得到的总酶活力减去所测定得到的a-淀粉酶活力是否就等于卩-淀粉酶活力？ 为什么？你的结论说明什么？答：不等于。因为P淀粉酶和a淀粉酶作用于a-1,4糖苷键，但二者都不能水解支链的a-1, 6- 糖苷键，而我们所测定得到的总酶活力是二者在与R酶的共同作用下测得的酶活力，R酶能 够降解支链淀粉，断裂a-1,6-糖苷键，从而增大了卩淀粉酶和a淀粉酶可水解的底物浓度，使 测得的总活力大于P淀粉酶和a淀粉酶单独作用的酶活力之和。我的结论说明实验时要考虑各种酶协同作用的综合因素七、参考文献1 生物化学实验指导中国农业大学生物化学实验室 中国农业大学自编教材2 根底生物化学 赵武玲 中国农业大学3 岳海凤1 ,2,郜庆炉2，薛香2小麦a-淀粉酶活性测定方法比拟（1.XX 农业大学，XXXX 450002 ; 2.XX 科技学院,XXXX 453003）4 百度百科淀粉酶 baike.baidu./view/212965.htm5 艾志录等 不同品种小麦发芽过程中淀粉酶活力变化规律的研究 中国粮油学报 2006年6月 第21卷第3期6 马永强等 玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究 食品科学 294297，2007, Vol. 28,No. 11