SSR分子标记剖析PPT课件

专业综合能力训练与测试专业综合能力训练与测试利用利用SSRSSR技术技术进行玉米杂交种的纯度鉴定进行玉米杂交种的纯度鉴定2012.5一、实验目的实验目的 玉米是我国的主要农业作物，利用SSR技术进行玉米种子纯度鉴定，已经筛选出多对可利用的引物，综合运用SSR核心引物和DNA指纹图谱，可以准确地鉴定父本、母本、混杂品种及真实杂交种，其鉴定结果与RFLP结果及系谱来源基本一致。SSR标记的简介及原理SSR标记的步骤及分析SSR标记引物设计二、SSR标记123SSR（simple sequence repeat）SSR标记简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下。SSR标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术。1.SSR标记的简介SSR分子标记的分子学基础分子标记的分子学基础 微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的常见的二核苷酸重复单位：（AC)n、（GA)n、（AT)n常见的三核苷酸重复单位：（AAG)n、（AAT)n SSR分子标记的分子学基础分子标记的分子学基础 微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了SSR标记。SSR分子标记原理分子标记原理l 根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR，电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。l 简而言之，就是通过对样本就是通过对样本DNA多态性的分析，多态性的分析，从而来得到样本从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调序列以及在遗传性状上的调控和差异。控和差异。SSR标记原理示意图标记原理示意图SSRSSR分子标记的优势分子标记的优势SSRSSR在真核生物基因组中分布广在真核生物基因组中分布广多态性丰富多态性丰富其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗传信传信 息量大息量大SSRSSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传通常为显性标记，呈孟德尔式遗传具有很好的稳定性和多态性具有很好的稳定性和多态性DNADNA用量少用量少技术要求低，成本低廉技术要求低，成本低廉PCRPCR扩增的可重复性高扩增的可重复性高 SSRSSR分子标记的劣势分子标记的劣势 开发和合成新的开发和合成新的SSRSSR引物投入高、难度大引物投入高、难度大 现有的现有的SSRSSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因标记数量有限，不能标记所有的功能基因 SSRSSR多态性的检测和应用很大程度上依赖多态性的检测和应用很大程度上依赖PCRPCR扩增的效果扩增的效果 SSRSSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。2.SSR分子标记的步骤分子标记的步骤第一步第一步：基因组DNA 提取第二步第二步：PCR第三步第三步：扩增产物电泳检测第四步第四步：结果分析微卫星分子标记对微卫星分子标记对18份基因型的扩增结果份基因型的扩增结果 引物引物设计设计二三一从有关数据库（从有关数据库（GenBank,EMBL DDBJ等）或文章中查等）或文章中查询询使用近缘种的引物使用近缘种的引物构建基因组文库构建基因组文库,筛选筛选SSR位位点点3.SSR3.SSR分子标记分子标记引物设计引物设计构建基因组文库构建基因组文库,筛选筛选SSR位点位点5锚定锚定PCR 分离分离SSR标记标记K可以跟任何核苷酸配对，V不能与A配对，R不能与G配对，其他核苷酸均可与它们配对。这样，VRVRV五个碱基一起构成了一个封闭碱基群。在PCR过程中，由于VRVRV不能与GA配对，该引物与模板DNA结合的时候，就不会在(GA)n重复区滑动，只会结合在如图1所示的位置上，以保证SSR位点的长度多态性不会丢失。三、实验用品三、实验用品仪器设备与耗材：仪器设备与耗材：PCR扩增仪、电泳仪和电泳槽、扩增仪、电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心管、管、PCR管、移液器枪头等管、移液器枪头等2.试剂试剂提取缓冲液：提取缓冲液：100mmol/L TrisCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5%SDS。氯仿：异戊醇：乙醇（氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。）。TE缓冲液：缓冲液：10mmol/L TrisCl（pH8.0），），1mmol/L EDTA（pH8.0）。）。SSR引物（引物（20对）对）,Taq DNA聚合酶（聚合酶（3U/l),dNTPs（10mmol/L）1.材料准备：材料准备：在温室种植10种不同来源的玉米杂交种，剪取其三叶期左右嫩叶以备DNA提取之用。四、实验操作步骤四、实验操作步骤2.DNA提取将玉米幼叶在研钵中加液氮磨成粉状后，取约0.1g放入1.5ml离心管中，立即加入0.5ml提取缓冲液（60水浴预热），摇动混匀。60水浴保温3060min（时间长，DNA产量高），不时摇动。加入0.5ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀，室温下静置510 min，使水相和有机相分层。室温下12000rpm离心5 min。小心移取上清液至另一1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。室温下12000rpm离心5 min，去除上清液，再加入100l TE溶解沉淀。加入1/10体积（约10l）的3mol/L NaAc及二倍体积（约300l）预冷的无水乙醇，混匀，-20放置20 min左右。室温下12000rpm离心5 min。去上清，用1ml 70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀干燥后，重新加入100l TE溶解，-20贮存,备用。3.PCR扩增 反应组分Component反应体积Volume(25L)dd H2O19L10buffer2.5LdNTPs(10mM)2LPrimer forward(10 uM)0.5LPrimer reverse(10 uM)0.5LDNA template（100 ng/L）0.25LTaq DNA ploymerase(5U/l)0.25L每小组选用3个模板，3对引物，进行如下的PCR扩增。PCR反应程序：预变性 94 5min 变性 94 30s 退火 55 30s 延伸 72 30s 共33个循环 最后72终延伸 10min 4.电泳检测：将扩增产物在3的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后观察结果并照相。5.SSR标记分析1.分析不同杂交种间的特异性的条带差异情况2.筛选出鉴定杂交种的SSR标记五、问题与思考1.SSR鉴别种子纯度的原理2.SSR标记电泳的结果及分析3.SSR标记在鉴定杂交种的实用性如何？Thank you!