染色体免疫共沉淀

染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究 的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会岀现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可 以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质 被切成很小的片断，并沉淀下来。实验步骤：第一步：用甲醛把细胞内的DNA结合蛋白与DNA交联起来具体步骤与注意事项1. 准备好一盘细胞量达到1 x 106的培养皿（注意：培养细胞时要适当处理细胞使得目的基因处于被转录的状态）2. 于培养基中加入适量的甲醛，使甲醛终浓度达到1%，37C下交联10分钟。（注意：交联的时间太短或太长都会影响最终的结果）3. 尽量的去掉培养基，然后用加了蛋白酶抑制剂的预冷PBS清洗细胞两次；4. 把细胞刮下，置于离心管中， 4C 2000 rpm 离心 4分钟；5. 去掉上清液，加入200微升裂解液（注意：每1 x 106个细胞加200微升裂解液），冰上裂解10分钟；第二步：用超声波的方法把DNA破碎成合适的大小（250bp至800bp），因为在第一步中用甲醛交联了细胞内的大分子，所以结合蛋白质的DNA片段相对没 那么容易被打断。具体步骤与注意事项6. 用超声波破碎细胞裂解液中的DNA至DNA的长度为250bp至800bp （注意：整个操作过程必须在冰上进行，破碎中途不断的跑胶检测DNA分子长度是否达到250bp至800bp）第三步：用特异性抗体与DAN结合蛋白结合，用免疫沉淀的方法法分离岀复合体。纯化岀复合体中的小片段DNA具体步骤与注意事项7. 把破碎好的细胞裂解液置于冰冻离心机中4C 13000 rpm离心10分钟，再把上清转移到2ml的离心管中；8. 用CHIP稀释液把细胞裂解液稀释10倍，并将此液称为原液（注意：稀释后取岀200微升原液作为Input样品）；9. 为了更好的去掉结果背景，往原液中加入75微升的蛋白A/G琼脂糖珠，4C孵育30分钟，再稍微离心一下，收集上清液（以下称为A液）；10. 把A液分为两份，一份加入结合目的基因的蛋白的抗体，一份加入Flag标签抗体，4C孵育过夜；11. 分别加入40微升的蛋白A/G琼脂糖，4C摇晃孵育1小时；（注意：孵育的时间不能太长，而且摇晃的速度要快）12. 700 至 1000 rpm 4C 冰冻离心 1 分钟，去掉上清，反复清洗琼脂糖珠四次（注意：务必把上清液彻底的去掉，否则残留的上清液会造成假阳性）；第四步：用PCR扩增特异DNA序列，以确定目的基因是否与抗原蛋白结合并最终被沉淀下来。具体步骤与注意事项13. 即时制备 Elution Buffer （1%SDS, 0.1M NaHCO3）；14. 往琼脂糖珠里加入120微升的Elution Buffer，室温下剧烈摇晃15分钟，2000g离心1分钟取上清液（以下称为B液）；15. 用PCR纯化试剂盒纯化B液，16. 纯化过的B液可以进行PCR分析（注意：检测时要带上之前取岀的部分原液作为In put对照）；注意：12步以后的结果可以加入25微升3 x上样缓冲液，沸水变性5分钟，离心取上清做Western Blot检测。染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传 信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰hIP不仅可以检测体内反式因子与）NA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体 基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来R是利 用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“orein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精 制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实 验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特 异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用 含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶 解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋 白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检岀抗 原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。