大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤

实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增 殖和表达。研究发现，用含Ca2+的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源 DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的 状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2 法。CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处 于0C、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外 源DNA附着于细胞膜表面，经42 C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复 合物。宿主细胞一般是限制一修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素 的基因（AP+）。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些 含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质 粒。本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感 受态，然后与PUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行 适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而 未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增 后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的 制作以及DNA测序等实验。二、仪器及试剂1. 仪器： 恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度 计、高速冷冻离心机、台式离心机。2. 材料E.coli JM109 受体菌、质粒 pUC18。3. 试剂：LB培养液（IL）：10g胰蛋白胨酵母粉5gNaCl10g （高盐）或5g （低盐）氨苄青霉素（Ampic il lin）100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨10g,酵母粉5g以及NaCl 5g溶于1L的重蒸水 中并高压灭菌。待冷却至55C，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml的氨苄青霉 素。然后贮存于4C备用。LB平板培养基：胰蛋白胨10g酵母粉5gNaCl10g 或 5g ,琼脂13g在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温 至50C，取出培养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液 中，根据需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。 90mm直径的培养皿约需3050ml培养基。培养基完全凝结后，倒置平皿并贮 存于4C备用。其它试剂： 0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水三、操作步骤1. 感受态细菌的制备：（1）用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，接种 于装有5ml LB液体培养基的试管中中，37C 220 rpm振荡培养过夜（12 16h）。（2）取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中 中，37C, 220 rpm 振荡培养 2 3h，隔 20 30min 测量 OD600 值，至 OD600 值 为0.3-0.4。无菌条件下将细菌转至1.5ml离心管中，每管1ml菌液，按需要 决定管数。(3) 4C, 12000 rpm，离心 2 min，以回收细菌。(4) 倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量培养液 流尽。每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min。(5) 4C，12000 rpm，2 min。(6) 倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮细胞(重悬时操作要轻)，即成感受态 细胞悬浮液。2. 细菌转化：(1) 取3只灭菌的Ep管，分别编号1、2、3、分别加入以下各组分：加入1020ng质粒DNA (体积小于10ul)，同时做两个对照组：1号：受体菌对照组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH202 号：质粒 DNA 对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC193号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19(2) 轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，促进DNA分子在感 受态细胞表面的吸附。(3) 转入42C水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用，使细胞膜产生 通道，便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。(4) 迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。(5) 加600u无抗生素lLB液体培养基，摇匀后于37C，220 rpm，振荡 60min。使受体菌恢复正常生长状态，并且表达Ampicillin抗性基因。(6) 取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至 液体被吸收，37C恒温培养箱倒置培养12 16h后观察结果，其余保存于 4C。如果平板上没有长出菌落，可将之置于37C恒温培养箱继续培养，同时 将剩下的500ul菌液离心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重 悬，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37C培养。（7）观察并记录转化子出现的数目，计算转化率。四、注意事项：1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超 净工作台上进行。3. 必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。4. 整个实验过程均需置于冰上。5. 选用对数生长期细胞，OD6OO不应高于0.6。