黑木耳菌丝黑色素结构性质

黑木耳菌丝黑色素结构性质初步研究李 琦，余 乐，蒋志武，马爱民作者简介：李琦(1986)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学与生物技术。E-mail： tomisqq 通讯作者：马爱民(965)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术E-mail：aiminma (华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070) 摘 要：对黑木耳菌丝黑色素提取及结构性质进行初步研究。发现黑木耳菌丝在生长过程中是不断黑化的； 从菌丝体中提取得到的黑色素物质，通过扫描电子显微镜观察其超显微结构，发现黑色素颗粒是由不均一 片状颗粒粘连而成；元素分析及 X 射线能谱仪分析了黑色素各种元素含量，发现了黑色素中含有 S 元素； 运用紫外可见光谱扫描发现酪氨酸合成黑色素最大吸收峰出现在210nm，黑木耳子实体黑色素，黑木耳菌 丝黑色素的最大吸收峰均出现在207nm ；傅里叶红外光谱扫描初步研究基本结构性质，可能是含有一 COOH、OH、NH、NH2、CH、C=O、CCH3 等官能团。关键词：黑木耳菌丝；黑色素；黑化；结构性质Study on structural property of melanin fromAuricularia auricular myceliaLI Qi, YU Le, JIANG Zhi-Wu, MA Ai-min*(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)Abstract：Melanin was extracted from Auricularia auricular mycelia and its structural property were studied. The results revealed that: melanization in A. auricula mycelia was depend on culture time; Beside structure property of melanin was studied by Scanning electronic microscope (SEM), X-ray energy dispersion spectroscopy (X-EDS), E lemental analysis, UV scanning and FT-IR scanning.Key words：Auricularia auricular mycelia；melanin；melanization；structural property中图分类号：TS202.3文献标识码：A文章编号：黑色素(melanin)广泛存在于动植物和微生物中，是由吲哚或酚类化合物氧化聚合而成的非均质高 分子化合物，一般呈黑色、褐色或者棕色 1-2。微生物所产黑色素主要分为胞内、壁结合和胞外黑色 素。黑色素能赋予生物体一些特殊的生物活性功能，如对生物体外表修饰降低紫外线辐射伤害、清除 体内自由基、抗氧化等功能，有研究发现黑色素能有效的清除活性氧自由基，保护生物大分子如 DNA 免受氧化伤害。对天然无毒副作用产品的强烈需求下，天然提取物添加剂在食品工业中的应用，如果黑木耳菌丝 发酵产黑色素的相关技术问题能很好解决，无疑是提供了一种纯天然无毒害作用的。国内外利用微生 物发酵产黑色素的研究也不断增加。1 材料与方法1.1 材料、试剂、培养基与仪器黑色素标样(酪氨酸氧化合成) 美国 Sigma 公司；黑木耳子实体黑色素 本实验室；黑木耳 单片 5 号菌种 华中农业大学实验菌种中心；其他试剂均为国产分析纯。PDA， PDB 培养基 Difco 公司。卧式圆形压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器公司； VD-1320 超净工作台 北京东联哈 尔滨仪器制造有限公司；JSM-6390/LV扫描电子显微镜日本NTC公司；X能谱射线仪 日本NTC公司；S-250D超声波细胞破碎仪美国Branson公司；J-E高速冷冻离心机美国Beckman公司；Alphal-2真空冷冻干燥机德国Eppendorf公司；UV-1700紫外可见分光光度计日本Shimadzu公司; Nexus 470傅里叶变换红外光谱仪美国Nicolet公司；Vario EL III元素分析仪德国Elementar公司。1.2 方法1.2.1 黑木耳菌丝黑色素的制备1.2.1.1 黑木耳试管母种活化在无菌条件下，用灭菌的解剖刀取0.5cmX0.5cm大小的外缘菌块接种于PDA平板培养基上，置 于25C培养10d。1.2.1.2 黑木耳菌丝液体母液制备取活化过的黑木耳菌株接种于装有100mL PDB培养液的250mL三角瓶中，25C生化培养箱培养 5d。1.2.1.3 黑木耳菌丝液体培养取液体培养的菌体母液，用玻璃研磨器研磨成匀浆装作为接种液，按 2%接种量接种于 100mL PDB培养液的250mL三角瓶中，25C生化培养箱培养。1.2.1.4 黑木耳菌丝黑色素提取、纯化黑色素的提取及纯化参考吴尧等的方法，略作修改：过滤收集黑木耳菌丝，用蒸馏水冲洗菌体， 将菌体液氮研磨捣碎后加入适量1mol/L氢氧化钠溶液，并用细胞破碎仪进行功率60W时间20min的 细胞破碎处理，10000rpm离心取上清液，1mol/L HCl调到pH 2.0，4000rpm离心收集沉淀，即得黑 色素粗品。适量黑色素粗品中加入6mol/L的HCl 30mL于100C水浴2h，4000rpm离心收集沉淀，用蒸馏 水漂洗3次，沉淀溶于pH 8.0的KOH中。加入一倍体积的氯仿：异戊醇（1： 5，V/V）上下颠倒数 次后离心收集上清液，重复三次操作。将所收集的液体用1mol/L HCl调到pH 2.0,离心收集沉淀。用 100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇梯度洗涤，再离心收集沉淀。沉淀用去离子水漂洗三次，冷冻干燥后 存于-20 C冰箱备用。1.2.2 黑木耳菌丝黑色素的结构性质1.2.2.1 黑色素的扫描电子显微镜特征 将黑色素冻干成粉末状，临界点干燥、离子溅射仪真空喷金镀膜后进行扫描电子显微观察。1.2.2.2 黑色素的能谱特征 将黑色素冻干成粉末状，临界点干燥、离子溅射仪真空喷碳镀膜后进行能谱特征分析1.2.2.3 黑色素的元素分析将黑色素冻干成粉末状，称取3mg样品，包锡膜后进行对CHNS元素进行定量分析分析1.2.2.4 黑色素的紫外可见光谱将少量黑色素溶于pH8的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液，40C温浴1h使色素溶解，离心1min，取上 清液在200600nm进行紫外可见光谱扫描。1.2.2.5 黑色素的红外光谱特征采用溴化钾压片法，按1： 200的比例加入纯化黑木耳黑色素和溴化钾，研成细粉进行压片。在 5004000cm-1范围内测定其红外吸收光谱。2 结果与分析2.1 黑木耳菌苔形态图1黑木耳菌丝形态Fig.1 The morphology of Auricularia auricuhapha melanin.如图1所示，图A、B分别是平皿培养7d、25d的菌苔形态，图C是平皿培养25d黑木耳菌丝平 皿底面的情况，可以发现有呈黑色斑点状分泌物出现。黑木耳菌丝在培养过程中菌丝是逐渐变黑的， 随着培养时间的延长，菌丝体黑化越明显，这可能与菌丝体黑色素分泌或培养后期生长条件恶化有关。 2.2 黑木耳菌丝黑色素的得率PDB液体培养15d的黑木耳菌丝过滤烘干后干重为0.392g,经处理所后得黑木耳菌丝黑色素粗品 0.025g，黑色素粗品再经一系列纯化处理，最终得香灰菌黑色素纯品0.014g。黑木耳菌丝黑色素的得 率为3.57%。2.3黑色素的扫描电子显微镜特征CDX20,000图(A、C)酪氨酸合成黑色素及(B、D)黑木耳菌丝黑色素扫描电子显微镜图片Fig. Scanning electronic microscope photographs of (A, C) synthetic tyrosine melanin, (B, D) melanin from A. auricular mycelia pure melanin.图2中，酪氨酸合成黑色素与菌丝黑色素的超显微形态，在外观形态结构上具有相类似，都为不 规则片状颗粒粘连而成。图AB比较发现，在扫描电子显微镜8000X放大倍数下，酪氨酸合成黑色素 的颗粒结构更为明显，而试验提取等到的黑木耳菌丝黑色素粘连成块状，可能是试验提取工艺本身的 原因，也可能是菌丝黑色素更容易吸潮而出现颗粒粘连。图CD比较发现，在扫描电子显微镜20000X 放大倍数下，箭头指示处酪氨酸合成黑色素清晰呈现出片状不规则结构，而菌丝黑色素更趋向于片状 圆形结构。2.4 黑色素的扫描电子显微镜特征图1(A)黑木耳子实体，(B)酪氨酸合成黑色素及(C)纯化黑色素能谱特征图片Fig. 8 X - ray energy dispersion spectroscopy (X-EDS) photographs of (A) Auricularia auricular myceliapure, (B) melanin from Auricularia auricular mycelia pure melanin, (C) synthetic tyrosine melanin.表黑木耳菌丝黑色素原子百分比Table元素ABC从X射线能谱分析图谱中发现，图ABC中S原子百分比分别为2.76%, 20.12%, 25.08%，从菌 丝中提取黑色素的过程中S元素类物质并没有减少，原子百分比含量不断增加，由此初步推断黑木耳 菌丝黑色素含有S的化合物。2.5 黑木耳黑色素的元素分析表2黑色素元素分析Table 2试验样品C%H%N%ABC2.6 黑木耳黑色素的紫外图谱特征从图1紫外扫描图谱中可以看出，3种黑色素在扫描范围(200600nm)内呈现了一致的吸收变 化规律，具有相似的光谱吸收特征，是典型的黑色素紫外吸收图像3。酪氨酸合成黑色素最大吸收波 长出现在210nm，黑木耳菌丝及子实体黑色素均出现在207nm，与报道的不同来源的黑色素的最大吸 收波长在210nm左右一致13。图2 (A)酪氨酸合成黑色素和(B)黑木耳纯化黑色素的对数吸光度对波长作图Fig.2 Linear plots of log absorbance versus wavelength of (A) synthetic tyrosine melanin and (B)A. auriculapurified melanin2.7 黑木耳黑色素的红外图谱特征404000350030002500200015001000500波数(cm-)图3(A)酪氨酸合成黑色素和(B)黑木耳菌丝黑色素傅里叶红外变换扫描图谱Fig3 FT-IR scanning for(A) synthetic tyrosine melanin, (B) A. auricular mycelia melanin国内外诸多文献报道了不同来源的黑色素的红外图谱特征，从图3中可见，2种黑色素的基本波形相似，可以推断出它们具有类似的官能团：1)在波数3387cm-i处都有较宽而强的吸收峰，说明存 在一OH和一NH结构，吸收峰宽而强可能由于一OH和一NH之间的氢键连接；1717.4cm-i处的吸收 峰是自由羧基基团一COOH引起的振动；1621.1cm-i处吸收峰是C=O的非对称振动及N-H变角振动 形成，说明可能存在一COOH； 1386.8cm-i处吸收峰是C-CH3的弯曲和骨架振动吸收参与形成；600 700cm-1 范围的吸收带很弱，表明苯环被取代，形成共轭体系。2）粗品黑色素在波数 2925.5cm-1 与 2850.9cm-i处的吸收峰是由于C-H伸缩振动形成，即为一CH和一CH2的共振吸收峰。3）在黑木耳 纯化黑色素与粗品黑色素的对比中发现，粗品黑色素纯化后2925.5cm-1与2850.9cm-i处的吸收峰明显 减弱，可能是由于纯化过程中反复碱溶酸沉、有机溶剂处理去除了粗品黑色素上连接的蛋白，多糖类 物质。4）根据红外谱图的类似性可初步将黑木耳黑色素归为3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）类黑色 素1,3。3 结 论参考文献：1 FOGARTY R V, TOBIN J M. 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