低温胁迫下水稻幼根乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因表达变化

低温胁迫下水稻幼根乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因表达变化梁燕;严建萍;谭湘陵【摘要】为研究低温胁迫下水稻幼根中乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)基因表达变化，选取南粳44号水稻种子,常规促发芽,待幼根发至长1cm时，将其随机分为对照组和试验组，分别置于25C和5C环境下，两组均分别在0、6、12、24、48、96h取根，提取RNA,逆转录，用荧光定量PCR法测定ADH和ALDH基因的表达量结果显示ADH和ALDH表达量均呈现出先降后升的变化趋势；试验组的表达量均显著高于对照组结果表明水稻ADH和ALDH在低温胁迫下表达量升高可能与低温抗逆性有关.期刊名称】江苏农业科学年(卷),期】2012(040)003【总页数】3页(P43-45)【关键词】ADH基因;ALDH基因;低温胁迫;表达【作者】梁燕;严建萍;谭湘陵【作者单位】南通高等师范学校,江苏南通226001;南通高等师范学校,江苏南通226001;南通大学生物工程研究所,江苏南通226019【正文语种】中文【中图分类】Q786低温易造成水稻幼苗死苗或僵苗，严重地威胁着水稻的生长发育，造成减产可达10%50%1。其原因可能是低温使植物光合作用减弱，呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增多，植物处于饥饿状态，严重影响了植物正常生长发育，甚至导致死亡。植物对低温的响应是一种积极主动的应激过程，低温通过诱导相关基因的表达来提高植物的抗性。迄今，低温诱导蛋白质主要还是通过分析其与已知蛋白质的同源性及一些生理现象确定2。低温诱导蛋白质除少数被确定为植物适应胁迫过程中的必需蛋白质外，大部分的功能及其表达机制仍不清楚。本试验研究了南粳44号水稻在5C低温下乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)、乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)基因的相对表达量变化，以期为水稻的抗寒机理研究和耐冷育种提供理论依据。1.1 1材料与方法试验材料南粳44号水稻种子，由江苏沿江地区农业科学研究所提供，常规促发芽，待幼根1cm时，移至人工气候箱中。试验组在5C低温下处理，对照组温度为25C,均分别在0、6、12、24、48、96h取根，用于提取RNA。主要试剂与仪器RNAiso总RNA提取试剂盒；反转录酶M-MLV,购自TaKaRa公司；荧光定量PCR试剂盒(ABIPowerSYBRGreenPCRMasterMix);引物，由上海英骏生物技术有限公司完成；ABI7500实时荧光定量PCR仪；ABI2720型PCR仪。其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯试剂，水为灭菌双蒸水。方法131总RNA提取取长约0.5cm根尖20根于研钵中，加入RNAisoPlus1mL充分抽提研磨，至裂解液呈透明状。转入离心管中，室温静置5min，加入0.2mL三氯甲烷，再室温静置5min,12000g离心15min后吸取上清液；加入等体积异丙醇，室温静置10min,12000g离心10min，弃上清液；用75%乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，弃乙醇，然后用适量的DEPC水溶解RNA。1.3.2反转录反应取各个样品总RNA1pL进行反转录，依次加入5xBuffer2pL、Mix0.5pL、随机引物0.5pL、RNA1pL,DEPC水补足体积，反应总体积10pL。37C保温15min,85C10s终止反应，-20C保存。1.3.3荧光定量PCR反应根据GenBank中注册的目的基因ADH(AB267278)、ALDH(AF162665)和内参基因Actin(X16280)序列，按照荧光定量PCR引物设计原则设计引物。ADH的正向引物为5-AGGGGGTGACGGAGCTTTCCC-3，反向引物为5-AGTCGCGCCAAATCCGGTGG-3，预期产物长度为323bp;ALDH的正向引物为5GGGGACGTACGAGCTCCGCG-3，反向引物为5GCCACCATTGGTACTTCAATCTGGG-3f,预期产物长度为654bp;Actin的正向引物为5fTGTATGCCAGTGGTCGTACCCA-3f,反向引物为5fTCACAATTTCCCGCTCGGCCG-3f,预期产物长度为204bp。各cDNA样品分别以ADH、ALDH和Actin为引物进行荧光定量PCR反应。反应体积为25pL:Mix(2x)12.5pL,正、反向引物各1pL,cDNA模板2pL,无菌水8.5pL。配制混合物充分混匀后平均分配到各反应管中。反应条件：95C变性30s;95C10s,60C34s,40个循环。荧光定量PCR扩增在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行，约98min后，反应结束。1.3.4荧光定量PCR数据分析采用比较CT法ACT),数据取3次重复的平均值。在样品扩增的同时，以试验中不同处理的cDNA模板混合样进行系列稀释制作标准曲线。本试验以5C和25C处理后不同时段的cDNA模板进行4倍稀释，以ADH、ALDH和Actin引物进行扩增获得标准曲线。通过标准曲线得到ADH、ALDH和Actin的扩增效率。各样品的相对定量分析以0h材料为对照，按文献3方法进行。2结果与分析2.1不同时间低温胁迫水稻幼苗形态学上的比较水稻幼苗在低温胁迫下，虽然总体上呈生长的趋势，但随胁迫时间的延长，在形态上与常温对照组的差距越大（图1）。2.2不同时间低温胁迫ADH、ALDH基因表达的定量检测采用“133”的方法对南粳44号水稻在不同淹涝时间下ADH、ALDH基因的表达情况进行分析。结果显示，在相同模板条件下，扩增曲线基本重合（图2）。熔解曲线均为单峰（图3），说明PCR产物没有二聚体的干扰。ADH的熔链温度为81.0C,ALDH的熔链温度为79.3C（图3）。在5C条件下，ADH与ALDH基因在24h前表达量呈下降的趋势，24h时最低，24h后表达量开始升高，96h表达量最高，表明ADH、ALDH基因在低温胁迫下表达量表现出先降低后升高的变化规律（表1）。在25C条件下，2种基因表达量变化趋势也是如此。而将5C条件下培养的试验组与25C条件下培养的对照组比较，又可见ADH基因的表达量除了24h时试验组低于对照组外，在6、12、48、96h时均是试验组高于对照组（表1）；ALDH基因的表达量在6、12、24、48、96h时均是试验组高于对照组（表1）。表125C和5C下水稻幼根ADH、ALDH基因表达情况取根时间（h）25C下基因的表达5C下基因的表达ADHALDHADHALDH01.000.251.000.301.000.251.000.3060.340.090.070.020.910.280.280.10120.110.050.020.010.680.210.070.05240.100.040.010.010.040.020.020.01480.030.010.070.021.060.350.160.05962.780.417.420.495.420.447.660.473讨论般认为，植物ADH和ALDH对乙醇代谢具有显著的调控作用4，其生化过程如图4所示。ADH和ALDH是植物组织中较普遍存在的酶5-6，与植物的抗逆生理有着重要的关系7-8。Christie等报道，冷害低温提高了玉米和水稻幼苗ADH活性和ADH基因的表达，认为这种能量代谢途径的改变有利于幼苗在冷害逆境中的存活，冬麦经低温驯化处理后，ADH活性提高了23倍，从而提高了冬麦的抗寒力9-10。本研究中，水稻ADH、ALDH基因在低温胁迫表达下呈现出先降后升趋势，这与上述结论致。笔者推测，这可能与在低温胁迫下水稻的呼吸速率先上升而后下降相关。呼吸速率上升是种保护性反应，因为放热多对抵抗冷害有利；而呼吸速率降低是伤害性反应，此时有氧呼吸受到抑制，无氧呼吸相对加强，致使乙醇、乙醛等积累而进一步引起水稻ADH、ALDH基因表达的增加，以提高水稻的抗低温能力11。本研究为水稻的抗寒机理和培育高品质抗寒植物品系研究提供了参考资料。参考文献:1 【相关文献】GemmaS，VichiS，TestaiE.Individualsusceptibilityandalcoholeffects：biochemicalandgeneticaspectsJ.AnnIstSuperSanita，2006，42(1)：8-16.2 冯志勇，米朔甫，陈明杰，等低温胁迫下香菇基因表达差异研究J.应用与环境生物学报，2006，12(5)：614-617.3 PfafflM.Anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timeRT-PCRJ.NucleicAcidsResearch，2001，29(9)：e45.杨跃生，简玉瑜植物的乙醇代谢及其在农业生产上的意义J.华南理工大学学报：自然科学版，1996，24(增刊)：98-102.4 梁燕，严建萍，谭湘陵通育粳1号水稻乙醇脱氢酶基因克隆与原核表达J.生物技术通报，2011(3)：94-96.严建萍，梁燕，沙向红，等通粳1号水稻乙醛脱氢酶基因的克隆及原核表达几生物技术，2010，20(3)：16-18.7 KirchHH，SchlingensiepenS，KotchoniS，etal.Detailedexpressionanalysisofselectedgenesofthealdehydedehydrogenase(ALDH)genesuperfamilyinArabidopsisthalianaJ.PlantMolBiol，2005，57(3)：315-332.8 赵森，陈永华，陈昊，等荧光定量PCR检测淹涝胁迫下水稻Adh2基因的表达量变化J.中国生态农业学报，2008，16(2)：455-458.9 ChristiePJ，HahnM，WalbotV.Low-temperatureaccumulationofalcoholdehydrogenase-1mRNAandproteinactivityinmaizeandriceseedlingsJ.PlantPhysiology，1991，95(3)：699-706.10 AndrewsCJ.AcomparisonofglycolyticactivityinwinterwheatandtwoforagegrassesinrelationtotheirtolerancetoiceencasementJ.JExpBot，1997，79：87-91.11 Kato-NoguchiH.LowtemperatureacclimationmediatedbyethanolproductionisessentialforchillingtoleranceinricerootsJ.PlantSignalBehav，2008，3(3)：202-203.