ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤细胞U87MG增殖的影响.ppt

1 ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤 细胞 U87MG增殖的影响 作者姓名（排序）： 李晓梅 作者单位： 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院 第一作者姓名及身份证号码：李晓梅 230204197304071424 通讯作者姓名： 耿敬姝 研究背景 INGs（ INhibitor of Growth肿瘤生长抑制因子） 是近些年发现一个肿瘤抑制基因家族，包括 ING1、 ING2/ING12L、 ING3、 ING4 、 ING5和三种酿酒酵母 INGs（ Yng1、 Yng2、及 Pho23） , 它们彼此之间保持较 高的同源性。 ING4基因是新近发现的 ING基因家族的 新成员，定位于人 12q13-32，由 8个外显子和 7个内含子 组成，编码 248个氨基酸分子。其功能可能与负性调 节细胞生长和接触抑制及血管生成有关。 国外研究发现，多种肿瘤中可发现存在 ING4基因 的异常或 ING4蛋白表达的降低，如乳腺癌、直肠 癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性胶质瘤及头颈部 鳞状细胞癌等。 研究证实 ING4 基因编码蛋白的表达水平随着脑 胶质瘤恶性程度的增高而降低。 ING4 基因在正 常脑胶质细胞中比低度恶性脑胶质瘤中的表达水 平高 2 3倍，比高度恶性脑胶质瘤中的表达水平 高 6倍。我们有理由推测 ING4基因的异常及蛋白 表达降低与胶质瘤发生发展有关。 已研究证实，该因子对神经胶质瘤的基因治疗具 有潜在的重要价值。为了进一步研究该因子对胶 质瘤的治疗价值，我们首先构建真核表达载体 pcDNA3.1-ING4,并利用脂质体 Lipofectamine2000 将其转入 U87MG细胞，通过检测 ING4基因的表达 的改变及胶质瘤细胞 U87MG细胞增殖所发生的改 变，推测证实 ING4对 U87MG细胞增殖的影响，并 进一步探讨 ING4抑制肿瘤细胞增殖的机制是否与 p53及 cyclinB1有关。 材料与方法 1. ING4基因的克隆、序列测定和真核表达载体的构建 。 引物设计 扩增目的基因片段 目的基因 ING4克隆及 真核载体 pcDNA3.1-ING4的构建 重组质粒的抽提纯化 、测序和鉴定 。 2. U87MG细胞培养、 ING4基因转染、筛选和表达。 U87MG细胞采用 DMEM10%进口小牛血清培养 用 Lipofectamine2000将 pcDNA3.1-ING4质粒和空载 pcDNA3.1质粒分别转染 U87MG细胞 在 G418压力下筛 选，建立稳定表达 ING4细胞模型 提取转染 ING4克隆 细胞基因及总蛋白，挑选高表达 ING4蛋白的 U87MG细 胞。 3. ING4对 U87MG细胞增殖影响的多方面研究。 细胞计数及生长曲线绘制 细胞集落形成计数 MTT法检测细胞生长情况 观察 ING4对胶质瘤细胞 U87MG放射治疗的是否有增 敏作用 以上实验均以转染空载质粒的细胞作为对照。 实验 给予 6000GY 射线下连续照射。 4. ING4抑制 U87MG细胞增殖的机制的研究。 设计 P53及 cyclinB1 的引物，采用 PCR进行基因扩增；应用 Western-blot方法 提取细胞中的总蛋白，检测分别转染目的基 因 ING4质粒及空载质粒 U87MG细胞中 ING4、 P53及 cyclinB1基因 蛋白表达情况，均以 GAPDH为内参照。 结 果 1.经测序成功扩增出未发生基因突变 的正确的 ING4功能片段，大小为 750bp。 2. ING4在转染目的基因质粒 U87MG细胞中的表达增高 。 3.绘制生长曲线、集落形成试验、 MTT检测显示转染 ING4 的瘤细胞生长受抑。见图 1.2.3 4. ING4增强 U87MG细胞对放射治疗的敏感性 .见图 4 . 0 200 400 600 800 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 pcDNA3.1ING4 pcDNA3.1 0 100 200 300 400 A B A:pcDNA3.1-ING4U87MG B:pcDNA3.1U87MG 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A B A:pcDNA3.1-ING4U87MG B:pcDNA3.1U87MG 0.32 0.34 0.36 0.38 0.4 0.42 0.44 0.46 A B A:pcDNA3.1-ING4U87MG B:pcDNA3.1U87MG 图 1 图 2 图 3 图 4 5.转染 ING4的 U87MG细胞 P53（图 1）及 cyclinB1（图 2.3） 的表达降低。 图 1 图 2 图 3 讨 论 Gong等在 2004年发现 ING4是一种信号分子，可 以调节细胞的存活、生长。 ING4的表达在人神经 胶质瘤组织中与正常脑组织比较是降低的，其表达 水平由低级别肿瘤到高级别肿瘤是逐渐下调的，提 示 ING4表达下降可能与胶质肿瘤的发生有一定关 系 。 我们构建 ING4真核表达载体，转染低表达 ING4的 U87MG细胞，并通过与转染空载质粒的瘤 细胞进行对照，发现无论是在基因水平还是蛋白 水平转染 ING4质粒的 U87MG细胞能够稳定高表达 ING4蛋白。同时我们进行了几种反映肿瘤细胞生 长增殖速度的实验，实验结果表明转染 ING4的瘤 细胞生长受到了明显的抑制，同时发现转染 ING4 瘤细胞在射线照射下致死率明显高于空载细胞， 说明 ING4能够抑制胶质瘤细胞的生长，可以提高 瘤细胞对射线的敏感性。 ING4是一种核蛋白，其 C端具有核定位信号 与 p53复合定位于细胞核内。 p53是一种多功能 蛋白，它的基本功能是作为转录反式作用因子 调节转录活性。研究表明 ING4功能的发挥是 P53 依赖的，在我们的研究中发现转染 ING4质粒后 瘤细胞中 P53的表达没有增加，是降低的，这说 明 ING4不是 P53的上游基因， ING4表达增强并不 引起 P53水平增高，可能通过调节 P53下游某种 基因的表达来抑制瘤细胞增殖 Shiseki等发现在转染 ING4的 RKO细胞株 48小时后 ING4基因的高表达引起 S期细胞数量减少，以及 G1/S和 G2/M期细胞数量增加，说明抑癌基因 ING4可能引起瘤细胞 G1/S期和 G2/M期发生阻滞 细胞的分裂是由一组称为细胞周期素 cyclin的蛋 白和一组依赖于 cyclin的蛋白激酶 CDK及其抑制物 CDKI所调控的。其中， cyclinB1是细胞周期 G2/M 检测点关键的调控因子。人类多种肿瘤发现有cyclinB1过表达，高表达的 cyclinB1不断促进肿瘤 细胞分裂和增殖，是肿瘤细胞增殖的重要因素。 我们用 RT-PCR及 Western-blot方法分别检 测稳定转染 ING4瘤细胞和转染空载质粒瘤细 胞中 cyclinB1的基因转录及翻译情况，结果显 示稳定转染 ING4的细胞 cyclinB1明显降低，也 就是可能由于瘤细胞高表达的 ING4蛋白抑制 了 cyclinB1基因的转录和翻译，从而提示高表 达 ING4蛋白抑制细胞生长，可能是由于降低 P53下游的 cyclinB1的表达来实现的。 综上所述，我们的研究结果显示，高表 达 ING4蛋白可抑制胶质瘤细胞的生长，它与 P53相互协同并抑制 P53的下游基因 cyclinB1转 录和翻译，使 cyclinB1蛋白表达降低，使胶质 瘤 U87MG细胞发生 G2/M期阻滞，抑制瘤细 胞增殖。同时我们发现 ING4还可以提高胶质 瘤细胞对放射线的敏感性。 ING4对神经胶质瘤的基因治疗具有潜在的重 要价值。