高分子科学与基因容载

2005/07/05基因工程和高分子科学1基因工程的两个重要领域：基因工程的两个重要领域：1）基因分离（）基因分离（DNA Separation）;2）基因重组（）基因重组（Gene Recombination）;2005/07/05基因工程和高分子科学2基因重组和高分子科学基因重组和高分子科学v 基因重组是基因重组是“双刃剑双刃剑”：优良的基因重组：物种改良、疾病防治；不良的基因重组：恶果难以预料；v 基因重组的策略：基因重组的策略：1）补充策略：转移所需基因；）补充策略：转移所需基因；2）纠正策略：定点修复变异基因；v 基因转移（基因转移（DNA Delivery）的实施：）的实施：1）活体直接转移（in vivo）；2）离体间接转移（ex vivo）；2005/07/05基因工程和高分子科学3 基因转移（基因转移（DNA Delivery）的方法）的方法v 物理方法：物理方法：基因枪（particle bombardment）；电穿孔基因转移技术（electoporation）；激光微束转移技术（lasermicrobeam-mediated transformation）；微注射法（microinjection）；超声导入（sonaporation）；基因针等等 简便完全；转移效率低（10-3）；特异性和稳定性差；长期表达能力低。2005/07/05基因工程和高分子科学4基因转移（基因转移（DNA Delivery）的方法）的方法v 生物学方法：生物学方法：使用病毒、细菌作为基因载体，将靶基因接到病毒基因上。反转录病毒：反转录病毒：感染效率高、免疫原性低、能长期表达、只感染分裂细胞、易被灭活；腺病毒：腺病毒：靶细胞范围广、感染效率高、短期表达水平高、难以长期表达、基因容量有限；其它病毒：其它病毒：噬菌体：噬菌体：最大隐患：病毒基因被重组。最大隐患：病毒基因被重组。2005/07/05基因工程和高分子科学5基因转移（基因转移（DNA Delivery）的方法）的方法v 化学方法：化学方法：裸露的裸露的DNA；DNA容载：加入凝聚剂，容载：加入凝聚剂，通过静电作用，静电作用，使舒展的DNA链塌缩，链塌缩，凝聚成纳米粒子，纳米粒子，再使DNA凝聚体进入靶细胞核。凝聚剂又为基因转移的载体基因转移的载体。2005/07/05基因工程和高分子科学6基因转移的化学方法基因转移的化学方法v 凝聚剂基本为阳离子化合物、包括高分子。凝聚剂基本为阳离子化合物、包括高分子。多价金属盐：Ca3(PO4)2、Co(NH3)6；多元胺：spermidine（亚精胺）、spermine（精胺）；脂质体和蛋白质；高分子载体高分子载体：聚乙烯基胺（PEI）、聚赖氨酸（PLys）、甲壳胺、聚氨基酯、聚磷酸酯等等；nPLysNH2CH2CH2NHnPEICOCHNHCH2CH2CH2CH2NH2NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH22005/07/05基因工程和高分子科学72005/07/05基因工程和高分子科学8高分子科学与基因转移高分子科学与基因转移v 高分子作为凝聚剂和载体：高分子作为凝聚剂和载体：结构确定、合成、改性 物理、生物、化学；DNA凝聚体形成、稳定和传输 物理、生物；v 基因在进入细胞核之前基因在进入细胞核之前 形成凝聚体；进入体内，即遭到免疫系统的攻击；免疫修饰；免疫修饰；游离于体内，被吸附、发生簇集；提高稳定性；提高稳定性；穿透细胞膜屏障；提高脂溶性和特异性；提高脂溶性和特异性；细胞中酶的“遴选”；细胞内液中不解体；细胞内液中不解体；进入细胞核；基因的释放、组合或失活；细胞核内解体；细胞核内解体；2005/07/05基因工程和高分子科学9DNA在基因转移过程中发生了什么？在基因转移过程中发生了什么？Schematic representation of DNA uptake by mammalian cells.Biochemistry,41(48),2002 140892005/07/05基因工程和高分子科学10DNA 凝聚（凝聚（DNA condensation）A:uncondensed plasmids；B,C:plasmids with discrete loci;D:Condensed plasmids;DOGS:DNA=2:1(dioctadecylamidoglycylspermine)(deposited on polyornithine-coated mica in 150 mM NaCl and imaged in 15 mM NaCl)v DNA 凝聚的本质：凝聚的本质：可逆的可逆的coil-glubule转变转变2005/07/05基因工程和高分子科学11DNA 凝聚（凝聚（DNA condensation）vDNA凝聚机理凝聚机理静电相互作用：静电相互作用：电荷比：电荷比：存在临界凝聚剂浓度，并与单阳离子（如Na+）浓度有关 阳离子聚合物阳离子聚合物的的化学结构化学结构：电荷数、电荷间距、氨基种类，其它相互作用：其它相互作用：水合作用等，熵的变化：熵的变化：高分子和DNA的构象、混合，DNA分子的持久长度：分子的持久长度：受离子强度影响，动力学考虑动力学考虑：多步凝聚过程，受动力学因素影响，离子强度离子强度和和pH值值2005/07/05基因工程和高分子科学12DNA 凝聚（凝聚（DNA condensation）v 高分子高分子/DNA凝聚体（凝聚体（polyplex）的结构）的结构 尺尺 寸寸：直径在30300 nm；形形 态：态：棒状、环状、球状、六方柱状；电荷密度：电荷密度：带正电荷；化学结构：化学结构：v polyplex的结构和基因传递的性能的结构和基因传递的性能 Compaction of DNA into spherical particles rather than the ionic charge of DNA complexes is important.Efficient receptor-mediated transfection occurred only when condensed DNA complexes had a spherical shape with a diameter of 1530 nm.There has not been any consensus regarding the relationships between the size and shape of DNA complexes,their ability to be taken up by cells,and the chemical structure of agents that cause the condensation of DNA.2005/07/05基因工程和高分子科学13DNA 凝聚（凝聚（DNA condensation）阳离子聚合物的化学结构：阳离子聚合物的化学结构：种种 类：类：PEI和PLys的比较；链结构链结构：线形PEI和支化PEI的比较；分子量：分子量：适中；盐的浓度：盐的浓度：电解质的加入和胶体的稳定性；仅在很窄的NaCl范围内，PLys和DNA才发生协同结合，此时DNA才可凝聚成球形、直径为1530 nm的凝聚体。动力学考虑：动力学考虑：快速混合和慢速混合；不同离子强度下混合；混合次序；“退火”处理；协同结合协同结合（cooperative binding）和非协同结合）和非协同结合 (binds to specific DNA molecules in a selective manner)PLys can beconjugated with ligands to achieve receptor-mediated uptake.2005/07/05基因工程和高分子科学14DNA 凝聚（凝聚（DNA condensation）v 涉及的问题涉及的问题 高分子化学：高分子化学：阳离子聚合物的结构设计（共聚物的使用）；高分子的制备和化学改性；热力学：热力学：DH、DS；高分子-高分子、高分子-DNA等相互作用；构象变化、混合熵；高分子物理：高分子物理：高分子构象、高分子的溶液；（先凝聚、后复合?）高分子载体的选择：高分子载体的选择：生物降解性、生物相容性；带正电荷；2005/07/05基因工程和高分子科学15DNA 凝聚体的稳定（凝聚体的稳定（Stabilization polyplex）v 两个含义：两个含义：稳定：稳定：在体外、体内能够长时间稳定存在，被靶向细胞容纳；解体：解体：靶向细胞的细胞核内释放DNA；v DNA 凝聚体稳定的不利因素：凝聚体稳定的不利因素：生物体免疫系统的生物体免疫系统的“攻击攻击”：裸露DNA易被清除；被被“首过首过”器官富集：器官富集：裸露DNA易被“收容”；被血红蛋白、巨噬细胞清除：被血红蛋白、巨噬细胞清除：带正电荷的凝聚体；体内的生理环境体内的生理环境：导致聚集或解体；阴离子质膜阴离子质膜的静电作用：的静电作用：非特异容纳或聚集；2005/07/05基因工程和高分子科学16DNA 凝聚体稳定凝聚体稳定的不利因素的不利因素 体内的生理环境：体内的生理环境：稀释作用、pH、离子强度、酶；实例实例：内吞体（凝聚体穿过细胞膜后被溶酶体吞噬形成）内吞体呈弱酸性（pH5）解体凝聚体；含核酸酶 分解DNA；阴离子质膜的静电作用阴离子质膜的静电作用 蛋白多糖的存在：动脉壁、关节、真皮等；蛋白多糖的组成：核心蛋白、硫酸化或羧基化的粘多糖；（透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素）与凝聚体结合：迟滞迁移、聚集、非特异容纳2005/07/05基因工程和高分子科学17DNA 凝聚体稳定的对策凝聚体稳定的对策v 凝聚体的包装：凝聚体的包装：亲水性聚合物（亲水性聚合物（PEG）：）：保护、隔离、水合作用；受受 体（体（receptor）：）：特异性容纳；受体介导内吞体系的配体包括半乳糖、甘露糖、乳糖、铁传递蛋白、表皮生长因子和抗体。交交 联：联：戊二醛、二硫键（“可控”）；形成稳定的超分子结构：形成稳定的超分子结构：DNA-脂质体的三明治结构；v 逃逸内吞体逃逸内吞体：加入碱性物质：加入碱性物质：氯喹；病毒的模拟：病毒的模拟：fusogenic peptide；2005/07/05基因工程和高分子科学18DNA 凝聚体的稳定凝聚体的稳定v 涉及的问题：涉及的问题：高分子化学：高分子化学：高分子的结构设计；高分子的制备和改性；胶体稳定性：胶体稳定性：凝聚体结构和稳定性；环境因素和稳定性；高分子吸附：高分子吸附：凝聚体吸附其它物质；凝聚体被细胞膜吸附；高分子载体的选择高分子载体的选择：形成稳定凝聚体、保护DNA；提供静电作用以外的稳定作用；无毒、可生物降解；生物降解性、生物相容性；介导细胞容纳、具有特异性；能够进行化学改性；释放DNA、具有智能性；能够进行化学改性；2005/07/05基因工程和高分子科学19DNA 凝聚的特异性和智能性凝聚的特异性和智能性v 特异性：特异性：目目 的：的：提高基因传递的感染率；主要方式：主要方式：受体介导；v 智能性：智能性：目的：目的：增强基因传递的基因表达；原理：原理：利用细胞核内外生理环境的差异；方式：方式：pH的差异（稳定嵌段（PEG）可在酸性环境下水解）化学物质（谷胱甘肽为还原性物质，可断裂二硫键）v 化学改性的方法：化学改性的方法：对高分子载体进行改性；对DNA/高分子凝聚体进行改性；2005/07/05基因工程和高分子科学20DNA 进入细胞核进入细胞核v 异体进入细胞核的途径：异体进入细胞核的途径：经核孔（55 nm in diameter）；在细胞分裂期；v 质粒质粒DNA进入细胞核：进入细胞核：借助借助NLS多肽多肽（nuclear localization signal）：组成小的凝聚体；组成小的凝聚体；高分子载体的结构设计：高分子载体的结构设计：组组 分：分：PLys/PEI、PEG、长链的脂肪族化合物；链结构：链结构：接枝、以酯键为桥键；改改 性：性：Lys/EI的氨基；交交 联：联：双硫键；2005/07/05基因工程和高分子科学21高分子容载高分子容载DNA的目标的目标高分子高分子/DNA凝聚体凝聚体 人工人工“病病毒毒”n The more extensive experimental and theoretical study of non-covalent interactions that stabilize the condensed state,and that lead to the adoption of toroidal or alternate morphology.n The kinetic pathways leading to condensation.between the monomolecular condensation of large DNAs and the multimolecular condensation of smaller ones.n The systematic study of the effects of specific DNA sequences on condensation,to understand the effects of sequence on the binding of condensing ligands and on the trace lattice that modulates ion and water structure in the solvent layer between apposing helices,and to elucidate the influence of local bending and twisting on the close approach of specific regions within global supercoiled structures.