酶工程 5化学修饰

第五章第五章 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰 酶分子化学修饰酶分子化学修饰在体外将酶分子通过人工的方法与在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学物质，特别是一些有生物相容一些化学物质，特别是一些有生物相容性的物质进行共价连接，从而改变酶的性的物质进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。这些化学物质称为修饰试结构和性质。这些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。究和疾病治疗。酶化学修饰的应用领域酶化学修饰的应用领域=在基础酶学研究上在基础酶学研究上4探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探测酶活性必需氨基酸的性质和数目4酶蛋白一级结构的测定酶蛋白一级结构的测定4酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白的结构变化与运动4酶蛋白部分区域的构象状态酶蛋白部分区域的构象状态4酶的作用机理与催化反应历程酶的作用机理与催化反应历程4酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态4酶的固定化技术酶的固定化技术4酶纯度的分析与检测酶纯度的分析与检测=在疾病治疗上在疾病治疗上4克服酶在体内的不稳定性克服酶在体内的不稳定性 4消除或降低酶的抗原性消除或降低酶的抗原性4有助于酶分子到达并集中于病灶部位有助于酶分子到达并集中于病灶部位=在工业上的应用在工业上的应用4酶稳定性提高，使生产成本降低酶稳定性提高，使生产成本降低4反应条件的改善和酶寿命的延长导致生反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。产工艺的技术革新和改进。大多数的化学修饰的目的在大多数的化学修饰的目的在于人为地改变天然酶的某些性质，于人为地改变天然酶的某些性质，创造天然酶所不具备的某些优良创造天然酶所不具备的某些优良特性甚创造出新的活性，扩大酶特性甚创造出新的活性，扩大酶的应用范围。的应用范围。酶经过修饰后，会产生各种各样酶经过修饰后，会产生各种各样的变化，概括起来有：的变化，概括起来有：提高生物活性（包括某些在修提高生物活性（包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变）饰后对效应物的反应性能改变）增强在不良环境中的稳定性；增强在不良环境中的稳定性；针对特异性反应降低生物识别能针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；力，解除免疫原性；产生新的催化能力。产生新的催化能力。主要内容主要内容第一节第一节 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法第二节第二节 酶化学修饰的基本要求酶化学修饰的基本要求第三节第三节 修饰酶的化学性质修饰酶的化学性质 酶的化学修饰的基本原理酶的化学修饰的基本原理大量研究表明，酶分子表面外形大量研究表明，酶分子表面外形的不规则、各原子间极性和电荷的不的不规则、各原子间极性和电荷的不同、各氨基酸残基间相互作用等使酶同、各氨基酸残基间相互作用等使酶分子结构的局部形成了一种包含了酶分子结构的局部形成了一种包含了酶活性部位的微环境，不管这种微环境活性部位的微环境，不管这种微环境是极性的还是非极性的，都直接影响是极性的还是非极性的，都直接影响到酶活性部位氨基酸残基的电离状态，到酶活性部位氨基酸残基的电离状态，并为活性部位发挥催化作用提供合适并为活性部位发挥催化作用提供合适的条件。的条件。但天然酶分子中的这种微环但天然酶分子中的这种微环境是可以通过人为的方法进行适境是可以通过人为的方法进行适当的改造，通过对酶分子的侧链当的改造，通过对酶分子的侧链基团、酶分子的功能基团等进行基团、酶分子的功能基团等进行化学修饰或改造，就可以获得结化学修饰或改造，就可以获得结构或性能更合理的修饰酶。构或性能更合理的修饰酶。酶经过化学修饰后，除了能减少酶经过化学修饰后，除了能减少由于内部平衡力被破坏而引起的酶分由于内部平衡力被破坏而引起的酶分子伸展打开外，还可能会在酶分子的子伸展打开外，还可能会在酶分子的表面形成一层表面形成一层“缓冲外壳缓冲外壳”，能在一，能在一定程度上抵御外界环境的电荷、极性定程度上抵御外界环境的电荷、极性等变化对酶分子的影响，进而维持酶等变化对酶分子的影响，进而维持酶活性部位微环境的相对稳定，使酶分活性部位微环境的相对稳定，使酶分子能在更广泛的条件下发挥作用。子能在更广泛的条件下发挥作用。酶化学修饰的基本原则都是酶化学修饰的基本原则都是充分利用化学修饰剂所具有的各充分利用化学修饰剂所具有的各类化学基团的特性，或直接或间类化学基团的特性，或直接或间接地经过一定的活化过程与酶分接地经过一定的活化过程与酶分子中的某种氨基酸残基（通常选子中的某种氨基酸残基（通常选择非酶活必需基团）产生化学反择非酶活必需基团）产生化学反应，从而对酶分子的结构进行改应，从而对酶分子的结构进行改造。造。在酶的化学修饰过程中需要在酶的化学修饰过程中需要涉及被修饰酶、修饰剂的性质以涉及被修饰酶、修饰剂的性质以及修饰反应条件的选择。及修饰反应条件的选择。一般在开始设计酶化学修饰反应时须对被一般在开始设计酶化学修饰反应时须对被修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性质修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性质等应尽可能全面掌握。等应尽可能全面掌握。在此基础上选择合适的化学修饰剂进行化在此基础上选择合适的化学修饰剂进行化学修饰，在选择化学修饰剂时，除了需要考虑学修饰，在选择化学修饰剂时，除了需要考虑修饰剂的种类、修饰剂上的反应基团的数目和修饰剂的种类、修饰剂上的反应基团的数目和位置以及修饰剂上反应基团的活化方法和条件位置以及修饰剂上反应基团的活化方法和条件以外，还需要考虑修饰剂的分子量等其它可能以外，还需要考虑修饰剂的分子量等其它可能会影响修饰反应的因素。会影响修饰反应的因素。值得注意的是酶的修饰反应值得注意的是酶的修饰反应一般总是尽可能在酶稳定的条件一般总是尽可能在酶稳定的条件下进行，需要尽可能少破坏酶活下进行，需要尽可能少破坏酶活性功能的必需基团，以提高酶和性功能的必需基团，以提高酶和修饰剂的结合率和酶活回收率。修饰剂的结合率和酶活回收率。酶的化学修饰反应条件主要包括酶的化学修饰反应条件主要包括体系中酶与修饰剂的分子比例、体系中酶与修饰剂的分子比例、反应体系（包括溶剂性质、盐浓反应体系（包括溶剂性质、盐浓度以及度以及pHpH等）等）反应温度和时间等反应温度和时间等一般来说，修饰反应条件随酶的性质、一般来说，修饰反应条件随酶的性质、修饰剂的种类、修饰反应的类型等的不同修饰剂的种类、修饰反应的类型等的不同而不同，一个合适的修饰反应需要由大量而不同，一个合适的修饰反应需要由大量的实验来予以确定。的实验来予以确定。第一节第一节 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法酶的表面修饰酶的表面修饰酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰与辅因子相关的修饰与辅因子相关的修饰金属酶的金属取代金属酶的金属取代酶的表面修饰酶的表面修饰化学固定化化学固定化酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用酶的大分子修饰作用酶的大分子修饰作用 大分子非共价修饰大分子非共价修饰 大分子共价修饰大分子共价修饰分子内交联分子内交联分子间交联分子间交联脂质体包埋脂质体包埋反相胶团微囊化：反相胶团微囊化：酶的表面修饰酶的表面修饰（一）化学固定化（一）化学固定化 一般是直接通过酶表面的氨基酸残一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。力学性质发生了改变。（二）酶的小分子修饰作用（二）酶的小分子修饰作用主要是利用一些小分子修饰试剂，通主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-COO-、-NH3+-NH3+、-SH-SH、-OH-OH、咪唑基等），、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。有乙基、糖基和甲基等。酶的表面修饰酶的表面修饰（三）酶的大分子修饰作用（三）酶的大分子修饰作用 非共价修饰非共价修饰 共价修饰共价修饰大分子非共价修饰大分子非共价修饰利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护作用，对酶进行有效的保护例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。的稳定性增加。大分子共价修饰大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（歧化酶（SODSOD），不仅可以降低或消除酶），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。延长了半衰期，从而提高了药效。（四）分子内交联（四）分子内交联增加酶分子表面的交联键数增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。性得到改善。（五）分子间交联（五）分子间交联利用一些双功能或多功能试剂将不同的利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。杂化酶可作为部分代谢途径的模型。（六）脂质体包埋（六）脂质体包埋一些医药用酶，如一些医药用酶，如 SODSOD、溶菌酶等，、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。脂质用脂质体包埋法纪可解决这些问题。脂质体是天然脂类或类固醇组成的体是天然脂类或类固醇组成的 微球体，微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞膜酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞膜的融合或内吞作用而进入细胞内。的融合或内吞作用而进入细胞内。（七）反相胶团微囊化（七）反相胶团微囊化近年来发展起来的酶在有剂相中进行催近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高。提高。一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性。纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性。加加H2O 疏水尾部疏水尾部 亲水头部亲水头部 加酶液加酶液 S PEEE 图：反相胶团的结构和酶的分布图：反相胶团的结构和酶的分布酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰 非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰 酶蛋白主链的修饰酶蛋白主链的修饰 催化活性基团的修饰催化活性基团的修饰 肽链伸展后的修饰肽链伸展后的修饰（一）非催化活性基团的修饰（一）非催化活性基团的修饰通过对非催化残基的修饰可以改通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是可氧化残基。子的，还可以是可氧化残基。（二）酶蛋白主链的修饰（二）酶蛋白主链的修饰主要是靠酶法进行修饰，用主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分水解，可蛋白酶对主联进行部分水解，可以改变酶的催化特性。以改变酶的催化特性。（三）催化活性基团的修饰（三）催化活性基团的修饰通过选择性修饰催化活性氨通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。称为化学突变法。（四）肽链伸展后的修饰（四）肽链伸展后的修饰酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠。当条件下，重新进行折叠。三、与辅因子相关的修饰三、与辅因子相关的修饰 对依赖辅因子的酶可用两种方法对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：进行修饰：如果辅因子与酶是非共价结合的如果辅因子与酶是非共价结合的 ,可以将辅因子共价结合于酶分可以将辅因子共价结合于酶分 子上；子上；引入新的具有更强反应的辅因子引入新的具有更强反应的辅因子四、金属酶的金属取代四、金属酶的金属取代酶分子中的金属离子可以被其他酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变酶的专一性、金属离子取代，可以改变酶的专一性、稳定性等。稳定性等。第二节第二节 酶化学修饰的基本要求酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：（一）酶的稳定性：（二）酶活性中心的状况：（二）酶活性中心的状况：（三）酶侧链基团的性质与反应性（三）酶侧链基团的性质与反应性二、修饰反应的条件：二、修饰反应的条件：（一）（一）pHpH与离子强度与离子强度 （二）修饰反应的温度与时间（二）修饰反应的温度与时间 （三）反应体系中酶与修饰剂的比例（三）反应体系中酶与修饰剂的比例一、被修饰酶的性质一、被修饰酶的性质（一）酶的稳定性（一）酶的稳定性包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及及pHpH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。的性质等。（二）酶活性中心的状况（二）酶活性中心的状况包括酶分子活性中心的组成，如参与活性包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。状、大小以及寡聚酶的亚基组成。（三）酶侧链基团的性质与反应性（三）酶侧链基团的性质与反应性1、对巯基的化学修饰：、对巯基的化学修饰：常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。试剂等。2、氨基的化学修饰：、氨基的化学修饰：常用的修饰试剂有乙酸酐、常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯(DNS)和和苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC)等。等。3、羧基的化学修饰：、羧基的化学修饰：水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、甲醇甲醇-盐酸酯化反应等。盐酸酯化反应等。4、咪唑基的修饰反应：、咪唑基的修饰反应：焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。5、吲哚基的化学修饰：、吲哚基的化学修饰：2-羟基羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等。硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸侧链基团的化学修饰：、甲硫氨酸侧链基团的化学修饰：H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等、光敏试剂、碘代乙酰胺等7、二硫键的化学修饰：、二硫键的化学修饰：2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。8、酚基的化学修饰：、酚基的化学修饰：N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试剂、二异丙基氟磷酸。剂、二异丙基氟磷酸。9、胍基的化学修饰：、胍基的化学修饰：丁二酮、丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。环己二酮、苯乙二醛等。二、修饰反应的条件二、修饰反应的条件修饰反应应尽量在酶稳定修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶条件下进行，并尽量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活活性必需基团，修饰率高，活力回收要高力回收要高（一）（一）pHpH与离子强度：与离子强度：pHpH决定了酶分子中反应基团的解决定了酶分子中反应基团的解离状态，酶的解离状态不同，其反应离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不同；另一方面，有些修饰试性能也不同；另一方面，有些修饰试剂在不同剂在不同pHpH下，与同一种基团反应可下，与同一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修饰以形成不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。反应也有重要影响。（二）修饰反应的温度与时间（二）修饰反应的温度与时间严格控制反应温度和时间可严格控制反应温度和时间可以减少或消除一些非专一性的修以减少或消除一些非专一性的修饰反应。饰反应。（三）反应体系中酶与修饰剂的比例酶与修饰试剂的比例可以酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。控制酶分子的修饰程度。第三节第三节 修饰酶的性质修饰酶的性质 迄今，已有迄今，已有100多种蛋白质（其多种蛋白质（其中许多是酶）被修饰后在很多领域中许多是酶）被修饰后在很多领域中显出许多优良特性。中显出许多优良特性。修饰酶的性质改变主要表现为修饰酶的性质改变主要表现为稳定性提高稳定性提高体内半衰期延长体内半衰期延长免疫原性和毒性降低或消除免疫原性和毒性降低或消除膜渗透性提高膜渗透性提高在体内的生物分布与代谢行在体内的生物分布与代谢行 为和药用酶的疗效得以改善为和药用酶的疗效得以改善在有机溶剂中的溶解度在有机溶剂中的溶解度耐有机溶剂变性的能力提高等耐有机溶剂变性的能力提高等 例：例：大肠杆菌大肠杆菌L-天冬酰胺酶作为治疗天冬酰胺酶作为治疗淋巴性白血病、恶性淋巴肿瘤的酶制淋巴性白血病、恶性淋巴肿瘤的酶制剂已在国外应用于临床，并且是治疗剂已在国外应用于临床，并且是治疗急性淋巴性白血病治疗指数最高的药急性淋巴性白血病治疗指数最高的药物。物。缺点：缺点：由于它来源于微生物，对人而由于它来源于微生物，对人而言是一种外源性蛋白，有较强的免言是一种外源性蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，而限制了其应和全身性过敏反应，而限制了其临床应用。临床应用。改进方法改进方法利用聚乙二醇修饰后的天冬利用聚乙二醇修饰后的天冬酰胺酶不仅可降低或消除酶的抗酰胺酶不仅可降低或消除酶的抗原性，而且可以提高酶的抗蛋白原性，而且可以提高酶的抗蛋白水解的能力，延长酶在体内半衰水解的能力，延长酶在体内半衰期，提高药效。期，提高药效。结果结果 美国美国FDA正式批准的用于治疗急性淋正式批准的用于治疗急性淋巴细胞白血病的培门冬酶（巴细胞白血病的培门冬酶（Pegaspargase,商品名为商品名为Oncaspar）即为）即为L-天冬酰胺酶的天冬酰胺酶的聚乙二醇螯合物，该产品已于聚乙二醇螯合物，该产品已于1994年首先年首先在美国上市。在美国上市。热稳定性热稳定性一般来说，经过化学修饰的酶，热稳一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性。了酶分子构象的稳定性。天然酶和修饰酶的热稳定性比较天然酶和修饰酶的热稳定性比较 酶酶 修饰剂修饰剂 修饰酶修饰酶 天然酶天然酶 处理条件处理条件(/(/时间时间)残留酶活残留酶活(%)(%)腺苷脱氢酶腺苷脱氢酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 过氧化氢酶过氧化氢酶 溶菌酶溶菌酶 尿激酶尿激酶糜蛋白酶糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min 37/100min 100/30min 100/30min 50/10min 50/10min 100/30min 100/30min 37/48h 37/48h 37/24h 37/24h 70 70 100 100 46 46 64 64 40 40 90 90 20 20 99 99 80 80 0 0 95 95 50 50体内半衰期体内半衰期经过化学修饰后很多酶的抗经过化学修饰后很多酶的抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及对热稳定性都有因子的能力以及对热稳定性都有增加和提高，也就相应提高了酶增加和提高，也就相应提高了酶在生物体内的半衰期，这一点对在生物体内的半衰期，这一点对提高药用酶的疗效至关重要。提高药用酶的疗效至关重要。天然酶与修饰酶在生物体内半衰期的比较天然酶与修饰酶在生物体内半衰期的比较酶酶修饰剂修饰剂半衰期或酶活残留率半衰期或酶活残留率(%)/时间时间天然酶天然酶修饰酶修饰酶羧肽酶羧肽酶C精氨酸酶精氨酸酶-淀粉酶淀粉酶谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶-天门天门冬酰胺酶冬酰胺酶L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶尿酸酶尿酸酶-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶超氧化岐化酶超氧化岐化酶尿激酶尿激酶氨基己糖苷酶氨基己糖苷酶A精氨酸酶精氨酸酶酰苷脱氨酶酰苷脱氨酶L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶过氧化氢酶过氧化氢酶右旋糖酐右旋糖酐右旋糖酐右旋糖酐右旋糖酐右旋糖酐糖肽糖肽聚丙氨酸聚丙氨酸白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白PVPPEGPEGPEGPEGPEG3.5 h1.4 h16%/2 h1 h3 h4 h10 min6 min20 min5 min1 h30min2 h0%/6 h18%/3 h17 h12 h75%/2 h8.2 h21 h20 h3 h4 h90 min35 min12 h28 h24 h10%/8 h65%/3 h修饰酶的抗原性修饰酶的抗原性由于酶分子结构上除了有蛋白水由于酶分子结构上除了有蛋白水解酶的作用位点（蛋白水解酶解酶的作用位点（蛋白水解酶“切切点点”）外，还有一些可以组成抗原决）外，还有一些可以组成抗原决定簇的氨基酸残基，当酶作为异源蛋定簇的氨基酸残基，当酶作为异源蛋白进入机体后就会诱发产生抗体，产白进入机体后就会诱发产生抗体，产生抗体与抗原之间的反应，这一反应生抗体与抗原之间的反应，这一反应不但能使酶失活，而且还会对机体造不但能使酶失活，而且还会对机体造成严重的伤害，甚至会危急生命。成严重的伤害，甚至会危急生命。解决的方法解决的方法有抗原性的天然酶可以通过有抗原性的天然酶可以通过化学修饰使酶分子中的一些组成化学修饰使酶分子中的一些组成抗原决定簇的基团与修饰剂之间抗原决定簇的基团与修饰剂之间通过共价键相互结合，从而破坏通过共价键相互结合，从而破坏了酶分子中抗原决定簇的结构，了酶分子中抗原决定簇的结构，进而使天然酶的抗原性降低，甚进而使天然酶的抗原性降低，甚至完全消除。至完全消除。原理原理大分子的修饰剂还有可能起大分子的修饰剂还有可能起到到“遮盖遮盖”天然酶上的抗原决定天然酶上的抗原决定簇以阻碍抗原与抗体之间的结合簇以阻碍抗原与抗体之间的结合反应。反应。通过化学修饰后修饰酶的抗原性变化通过化学修饰后修饰酶的抗原性变化酶酶修饰剂修饰剂修饰酶的抗原性变化修饰酶的抗原性变化胰蛋白酶胰蛋白酶过氧化氢酶过氧化氢酶精氨酸酶精氨酸酶酰苷脱氨酶酰苷脱氨酶尿酸酶尿酸酶谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶超氧化岐化酶超氧化岐化酶L-L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶超氧化岐化酶超氧化岐化酶L-L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶尿酸酶尿酸酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶核糖核酸酶核糖核酸酶链激酶链激酶胰蛋白酶胰蛋白酶L-L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶PEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白PEGPEG聚聚DL-DL-丙氨酸丙氨酸PEGPEG聚聚DL-DL-丙氨酸丙氨酸聚聚DL-DL-丙氨酸丙氨酸消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除消除降低降低降低降低 值得指出的是值得指出的是，并不是所有，并不是所有的修饰剂都能在对酶进行修饰后的修饰剂都能在对酶进行修饰后就消除或降低天然酶的抗原性，就消除或降低天然酶的抗原性，有些修饰剂在降低和消除天然酶有些修饰剂在降低和消除天然酶的抗原性上并没有作用。的抗原性上并没有作用。例如，包括右旋糖酐在内的例如，包括右旋糖酐在内的多糖类物质就不容易消除或降低多糖类物质就不容易消除或降低天然酶的抗原性。天然酶的抗原性。目前比较公认的在消除或降目前比较公认的在消除或降低天然酶抗原性的修饰剂主要有低天然酶抗原性的修饰剂主要有PEGPEG和人血清白蛋白。和人血清白蛋白。最适最适pH部分酶经过化学修饰后，其催化部分酶经过化学修饰后，其催化的最适的最适pH会发生变化，修饰酶的最适会发生变化，修饰酶的最适pH与天然酶的最适与天然酶的最适pH相比往往不同，相比往往不同，且有些酶的最适且有些酶的最适pH会有一定的范围，会有一定的范围，更适合于酶的应用，尤其是在生理或更适合于酶的应用，尤其是在生理或临床应用上有较大的意义。临床应用上有较大的意义。天然酶与修饰酶的最适天然酶与修饰酶的最适pH酶酶修饰酶修饰酶天然酶天然酶修饰剂修饰剂糜蛋白酶糜蛋白酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶吲哚吲哚-3-链烷羟化酶链烷羟化酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶产朊假丝酵母尿酸酶产朊假丝酵母尿酸酶白蛋白白蛋白PEGPEG聚丙烯酸聚丙烯酸肝肝 素素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0例例1：来源于猪肝的天然尿酸酶的最适来源于猪肝的天然尿酸酶的最适pH值为值为10.5，在，在pH 为为7.4的生理环境中酶活的生理环境中酶活损失达损失达90%95%，不适合直接应用；，不适合直接应用；如果用白蛋白进行修饰后，修饰酶的如果用白蛋白进行修饰后，修饰酶的最适最适pH范围扩大，在范围扩大，在pH为为7.4时仍有时仍有60%的酶活得以保留；的酶活得以保留；与天然尿酸酶比较，修饰酶就更有利与天然尿酸酶比较，修饰酶就更有利于在生理条件的机体内发挥作用。于在生理条件的机体内发挥作用。例例2：天然的吲哚天然的吲哚-3-链烷羟化酶经链烷羟化酶经过修饰后，修饰酶的最适过修饰后，修饰酶的最适pH从从3.5变到变到5.5，在，在pH为为7时，修饰酶的时，修饰酶的酶活比天然酶要增加酶活比天然酶要增加5倍，相应地倍，相应地修饰酶在生理环境下的抗肿瘤效修饰酶在生理环境下的抗肿瘤效果就要比天然酶大得多。果就要比天然酶大得多。酶学性质的变化天然酶经过修饰后，绝大多数酶的最大反应速度Vmax没有变化，但有些酶被修饰后，其米氏常数Km会增大 天然酶与修饰酶的Km的对比酶酶修饰剂修饰剂Km天然酶天然酶修饰酶修饰酶苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶尿酸酶尿酸酶(猪肝猪肝)产朊假丝酵母尿酸酶产朊假丝酵母尿酸酶L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶尿酸酶尿酸酶腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶吲哚吲哚-3-链烷羟化酶链烷羟化酶吲哚吲哚-3-链烷羟化酶链烷羟化酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶(猪肝猪肝)产朊假丝酵母尿酸氧化酶产朊假丝酵母尿酸氧化酶精氨酸酶精氨酸酶谷氨酰氨酶谷氨酰氨酶-天门冬酰氨酶天门冬酰氨酶胰蛋白酶胰蛋白酶L-天门冬酰氨酶天门冬酰氨酶PEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白右旋糖酐右旋糖酐聚丙烯酸聚丙烯酸聚顺丁烯二酸聚顺丁烯二酸PEGPEGPEG糖肽糖肽右旋糖酐右旋糖酐聚丙氨酸聚丙氨酸6 10-52 10-55 10-54 10-53.5 10-53 10-52.4 10-62.4 10-62 10-55 10-56 10-31.2 10-47 10-55.6 10-56.5 10-58 10-57 10-57 10-63.4 10-66.9 10-55.6 10-51.2 10-2不变不变不变不变不变不变对各类失活因子的抵抗力对各类失活因子的抵抗力化学修饰酶与天然酶相比化学修饰酶与天然酶相比,对蛋对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高有不同程度的提高 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶酶抗抑制剂抗抑制剂抗蛋白酶抗蛋白酶修饰剂修饰剂抗失活剂抗失活剂过氧化氢酶过氧化氢酶核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白酶胰蛋白酶 -葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶尿激酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗抗SDSSDS抗大豆抑制剂抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂抗胎盘抑制剂抗尿素抗尿素抗抗SDSSDS作业题：1、名词解释：酶分子修饰2、酶分子的化学修饰方法有哪些？4、分析说明修饰酶的性质。