微生物实验设计

麻黄中生物碱的鉴定及其抑菌作用 前言麻黄（herba ephedrae）为麻黄科草麻黄(Ephedra sinica Stapf.)、中麻黄(Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(Ephedra equisetina Bge.)的干燥草质茎。具有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿的作用。麻黄中含有多种生物碱,因产地和品种的不同有一定的差异,一般以麻黄碱和伪麻黄碱为主,此外还含少量甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱和去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱。 实验目的1. 掌握培养基的制备，无菌接种等基本手段 ；2. 掌握麻黄中生物碱类化学成分的的提取、分离及鉴定技术；3. 研究及鉴定麻黄体生物碱外抑菌作用。实验原理 根据中药化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。 离子交换树脂法：利用生物碱盐能够交换到强酸型阳离子树脂柱上，将麻黄草的酸性水提液通过离子交换柱，用酸性液洗脱，由于麻黄碱的碱性比伪麻黄弱，可先从树脂柱上洗脱下来，从而使两者达到分离。实验仪器与材料1. 材料：麻黄、阳离子交换树脂、平皿、接种环、恒温干燥箱、定性滤纸、试管、镊子、棉拭子蘸、移液管、高压锅、生化培养箱等2. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、志贺氏痢疾杆菌3. 所需培养基：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基及牛肉膏汤琼脂培养基。实验步骤1. 麻黄中生物碱的提取、分离、鉴定1.1麻黄中生物碱提取、分离中药酸水提取液（盐） 过阳离子交换树脂柱（RSO3- H+） 树脂柱（RSO3BH+） 氨液碱化（游离）氯仿提取 回收溶剂 总生物碱 流出液（水溶性杂质）2.1麻黄中生物碱鉴定（l）氯化汞沉淀反应 麻黄中生物碱在氯化汞的乙醇溶液中发生反应生成黄色沉淀，加热后沉淀变为红色。在同样条件下，与氯化汞反应生成白色沉淀。这是因为甲基麻黄碱的碱性较强，加热时能使氯化汞转变成氧化汞（砖红色），而去甲基麻黄碱生物的碱性较弱，与氯化汞反应只能生成白色的分子复盐沉淀。（2）Vitali反应 麻黄中生物碱以甲基麻黄碱和去甲基麻黄碱生物碱分子结构为主，当用发烟硝酸处理时，发生硝基化反应，生成三硝基衍生物（黄色），若再与醇钠溶液反应，发生分子内双键重排，生成醌型结构的衍生物而呈深紫色，渐转暗红色，最后颜色消失。 2. 麻黄生物碱外抑菌作用2.1 抑菌环直径大小的测定（琼脂扩散法） 2.1.1 麻黄溶液配制 称取麻黄10 g，加注射用生理盐水至20 mL配制成0.5 g/mL的药液，然后稀释成12、14的药液，冰箱保存备用。 2.1.2 药敏纸片的制备 将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径为6.0 mm，置于干燥洁净的试管内，放入高压锅中经122.2 、15 min高压灭菌后，取出放入恒温干燥箱内进行干燥。取经干燥后的纸片一定数量，每片吸取不同浓度的麻黄溶液20 L，置于37恒温箱中，待干，备用。 2.2.2 菌悬液制备 供试菌种经传代纯培养后，取一接种环菌接种于营养肉汤培养基中，37恒温培养6 h，菌液浓度相当于9亿个菌体/mL，11000稀释后备用。 2.1.4 纸片琼脂扩散法 取直径12 cm平皿，倾入营养琼脂培养基15 mL，冷凝后用灭菌的棉拭子蘸取供试菌菌液均匀涂抹在培养基表面，室温放置23 min，用无菌镊子将在不同浓度的药液中浸润的纸片均匀间隔贴于各琼脂培养基表面，轻压纸片使接触良好，放入37恒温培养箱中，24 h后取出，观察抑菌圈，测量并记录结果。每个浓度的药物抑菌实验重复3次，抑菌结果为3次实验平均值。 判定标准：抑菌圈直径小于9 mm为低度敏感，9.111 mm为中度敏感，11.115 mm为高度敏感。 2.2 最低抑菌浓度（ MIC）的测定(平皿法) 2.2.1 牛肉膏汤琼脂培养基的制备 100 mL蒸馏水内加入牛肉膏0.3 g, 蛋白胨1.0 g, 氯化钠0.5 g, 琼脂2.0 g, 加热溶解, 用氢氧化钠调pH值至7.27.6, 双层纱布过滤, 分装, 高压灭菌。 2.2.2 药物平板培养基的制备 取灭菌试管6支, 依次编号, 按无菌操作法,用移液管吸取无菌生理盐水加入各试管,每管3 mL, 然后吸取麻黄溶液(1 g/mL)3 mL, 加入第1管, 并反复吹匀, 接着从第1管吸出3 mL, 放入第2管, 吹匀, 再从第2管吸出3 mL放入第3管。依此法按二倍稀释法稀释到第6管, 第1管至第6管依次被稀释成2、4、8、16、32和64倍, 分别为0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3和0.015 6 g/mL。取7个无菌平皿编号, 27号平皿分别加入上述16管试管已稀释的药液2 mL, 1号平皿加入未稀释的药液2 mL, 然后向平皿内倒入已溶化并冷却至40左右的牛肉膏汤琼脂培养基18 mL,立即摇动平皿,使培养基和药液充分混匀,待琼脂凝固后,即为含药物的平板培养基, 其含药液的浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.031 3和0.015 6 g/mL。 2.2.3 细菌的接种和培养 将保存的各实验菌种分别接种在营养肉汤培养基内, 37 生化培养箱中培养16 h,经比浊法判定菌量后，再用营养肉汤培养基稀释至含菌量为1105 cfu/mL的菌悬液，将浓度为1105cfu/ml菌液5L点种于系列浓度含药平板上，并以不含药的平板点种做空白对照。接种好后放37生化培养箱中培养24 h取出,观察不同细菌在不同浓度的药物平板上的生长情况, 平板上有菌落生长用“+”表示，无菌落生长用“-”表示，使细菌不生长的最低浓度为药物对该菌MIC。实验预期结果预期麻黄体外对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、绿脓杆菌有明显的抑制作用，抑菌作用的强弱随药物浓度的增加而变化，对4种菌的MIC依次为：0.062 5、0.031 3、0.062 5、0.031 3 mg/mL。实验分析本实验采用离子交换树脂法对麻黄中生物碱的提取、分离,应用体外抗菌实验来考察麻黄的抗菌作用，该方法简便经济。采用纸片琼脂扩散法、平皿稀释法同时进行体外抗菌实验研究。实验的结果容易受外界因素影响，如药物的种类、颜色、浓度等。参考文献1 卢芳国，朱应武，田道法，等.12个中药复方体外抗菌作用的研究J.湖南中医学院学报，2004，24（4）：911.2 沈萍，陈向东，等微生物学. 第二版，2006，5.3 沈萍，陈向东，等微生物学实验. 第四版,2007,11.麻黄中生物碱的鉴定及其抑菌作用 第 5 页 共 5 页