HPLC指纹图谱建立的技术要求.ppt

第四节 HPLC指纹图谱建立的关键技术要求 一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定） 应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。 供试品的取样参照 中华人民共和国药典 2010年版中规定的中药材 取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。 按 1： 10取样。 二、供试品制备 必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组 分应分别提取制备。 三、参照物的制备 选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适 宜的内标物作为参照物。 四、测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先 考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法， 建立多张指纹图谱。 注意方法学考察。 1、指纹图谱 第一，指纹图谱记录时间一般为 1小时，但应提供 2小时的记录 图。第二， TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化 学成分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。 2、共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计 算指纹的相对保留时间。根据 10批次的检测结果，标定中药材的共有 指纹峰。 3、共有指纹峰面积的比值 （ 1）以参照物峰面积作为 1 （要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指 纹峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标 物）。 （ 2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰 （要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为 1，计算其 他各共有指纹峰面积的比值。 （ 3）各共有峰的面积比值必须相对固定。 （ 4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积 20%的 共有峰 ，其差 值不得 20%；若 20%面积 10%共有峰 ，其差值不得 25%； 若 面积 10%的 共有峰 ， 峰面积比值不作要求 ，但必须标定相对保留时 间。未达到基线分离的 共有峰 ，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积， 同时标定该组各峰的相对保留时间。 4、非共有峰面积 非共有峰总面积不得 总面积的 10%。 5、方法学考察 （ 1）稳定性 主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测， 考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。 （ 2）精密度 主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样 5次以上，考 察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相 对标准偏差 RSD不得大于 3%。 （ 3）重现性 主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品 5份以上，按 照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相 对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差 RSD不得大于 3%。 6、其他注意问题 （ 1）样品定容 一般制成样品的标示浓度单位为 g/ml或 mg/ml。 （ 2）放置 供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存， 一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过 48小时。 （ 3）有效数字 相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点 后 3位。 （ 4）留样 注意留样的数量不少于实验实际用量的 3倍。 （ 5）参照物 复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照 物的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。 （ 6）量化的含义 是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征 上可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面的总体 差异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在 “量”的相对程度。 （ 7）相似度软件 2004年 SFDA 中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件 ，一 般成品指纹图谱相似度计算结果在 0.9-1.0之间为符合要求。 图 2 福建太子参 HPLC指纹图谱 图 1 福建莲子 HPLC指纹图谱 第五节 研究实例 丹参 HPLC指纹图谱构建 一、药材来源（ GAP基地）与鉴定 二、色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇 -0.1%乙酸 （ 5： 95）为流动相；检测波长 254nm；柱温为室温；流 速为 1ml/min。 四、供试溶液的制备 40目， 10批次，各 1g（精密称取），蒸馏水提取， 趁热过滤，得提取液 100ml，加 10%盐酸调 pH为 2，再用 乙酸乙酯 40ml萃取 1次。萃取液浓缩至干，残渣用 1ml流 动相溶解，作为供试品溶液， HPLC分析前用微孔滤膜过 滤。 五、测定 分别取各批次药材供试品 10l，注入 HPLC仪，记录 1h色谱。 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有 良好的相似性。 指纹图谱应有 12个特征峰。 相对保留时间 /min（特征峰序号） 0.150（ 1）、 0.368（ 2）、 0.437（ 3）、 0.495（ 4）、 0.591（ 5）、 1.000（ S）、 1.143（ 6）、 1.393（ 7）、 1.627（ 8）、 2.585（ 9）、 2.911（ 10） 3.968（ 11）。 特征指纹峰面积积分相对比值 0.152 30%(1)、 0.72(2)、 0.191 30%(3)、 0.297 25%(4)、 0.046(5)、 1.000(S)、 0.059(6)、 0.038(7)、 0.139(8)、 0.354 25%(9)、 0.411 25%(10)、 0.054(11)。 仪器 Agilent HPLC及 3D色谱工作站；色谱柱： Zorbax C18 （ 4.6mm250mm）色谱分析柱 .