微生物标本的质量控制细菌室黄红卫.ppt

微生物标本的质量控制 细菌室：黄红卫 2 3 4 近日，继出台被称为“史上最严” 的抗菌药物临床管理办法后，卫生 部开始在全国范围内对抗菌药物临 床应用进行专项整治。“作为全球 抗生素滥用最严重的国家，我国平 均每年每人要挂 8瓶水。”卫生部药 政司副司长姚建红日前表示，抗生 素毁掉中国一代人。 光明日报 抗生素毁掉一代人！ 5 超级细菌是人造的！ 6 重视微生物检验，为抗菌药物的合 理使用提供依据，努力做到 有的放 矢，精确打击。 7 细菌室日常工作三步曲 寻找它 认识它 控制它 培养 鉴定 药敏 重视微生物检验标本的质量 正确的微生物标本采集和运送，是准确的 病原学诊断的前提！ 只有合格标本培养出的病原菌才具有临床 意义，其药敏结果才具有治疗价值。 9 我们的现状 血培养：凝固酶阴性葡萄球菌 2008年 58% 2009年 60% 2010年 64% 痰培养：多次培养重复性差 分泌物：杂菌多重取，脓液无菌生长 基本原则 发现感染应及时采集微生物标本作病原学检 查，二、三级医院微生物标本送检率不应低于 70%。 尽量在抗菌药物使用前采集标本。 标本采集时应严格执行无菌操作，减少或避 免机体正常菌群及其他杂菌污染。 标本采集后应立即送至实验室。床边接种可 提高病原菌检出率。 基本原则 以棉拭子采集的标本如咽拭、肛拭或伤口拭子， 宜采用插入运送培养基送检。 混有正常菌群的标本如咳痰、尿液、伤口拭子， 不可置增菌培养基内送检。 盛标本容器须无菌、密闭。 送检标本应注明来源和检验目的，使实验室能 正确选用相应的培养基和适宜的培养环境。 注意事项 临床微生物标本的采集应在抗生素应 用前或停药一周后进行，如不能停用 抗生素，应于下次抗生素应用前采集。 各种标本采集后应立即送检；无菌部 位的标本采集应严格无菌操作。 血液及骨髓标本 标本送检 病人出现以下临床表现，或同时具备以下几种临床表现时应采集 血培养。 1 发热（ 38 ）或低温（ 36 ） 2 寒战 3 白细胞增多（ 10 109/L，特别有 “核左移 ”时） 4 粒细胞减少（成熟的多形核白细胞 1 109/L） 5 血小板减少 6 皮肤、粘膜出血 7 昏迷 8 多器官衰竭 9 血压降低 10 呼吸加快 标本的采集方法 防止皮肤寄生菌或环境微生物引起的污染是血培养的 键问题，采血前严格执行消毒程序是十分重要的。 1 皮肤消毒程序： 严格按以下三步法进行： (1) 70%酒精擦拭静脉穿刺部位待 30s 以上。 (2) 用一根碘酊或聚维酮碘（碘伏）棉签消毒皮肤， 1 2 碘酊作用 30s 或聚维酮碘作用 60s，从穿刺点向外画圈消 毒，至消毒区域直径达 3cm以上。 (3) 70酒精脱碘。 对碘过敏的病人只能用 70%酒精消毒，消毒 60s。 待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。 2 培养瓶消毒程序 (1) 用 70酒精消毒血培养瓶橡皮塞子。 (2) 酒精作用 60s。 (3) 在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布或棉签清除橡皮 塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。 3 培养瓶接种程序 抽取血液后，不要换针头，直接注入血培养瓶中，轻轻颠倒 混匀，以防血液凝固。如果同时作需氧和厌氧培养，应先 将标本接种到厌氧瓶中，然后再注入需氧瓶，严格防止将 空气注入厌氧瓶中。 标本采集注意事项 1 血培养采集的时间和频率 (1) 采血培养应尽量在抗菌药物使用之前，在 24h 内采集 2 3 份血培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单 份血培养），每次 2 瓶。 (2) 入院前 2周内接受抗菌药物治疗的患者，连续 3 天，每天 采集 2 份，可选用能中和或吸附抗菌药物的培养基。 (3) 对间歇性寒战或发热的患者，应在寒战或体温高峰到来 之前 0.5 1h采集血液，或于寒战或发热后 1h 采集。因为 发热时血液中可能没有细菌。 （ 4) 可疑为急性原发性菌血症、真菌血症、脑膜炎、骨髓炎、 关节炎或肺炎的患者，应在不同部位采集 2 3 份血培养。 (5) 不明原因发热，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热，先采集 2 3 份血标本， 24 36h 后估计体温升高之前，再采集 2 份以上。 (6) 可疑为菌血症或真菌血症，但血培养持续阴性，应改变 血培养方法，选择其它种类的培养瓶，如高渗培养瓶，中 和抗生素培养瓶，结核菌培养瓶等，以获得罕见的或苛氧 的微生物。 (7) 可疑为细菌性心内膜炎，在 1 2h 内多部位采集 3 份血标 本，如果 24h阴性，再采取 3 份以上的血标本。 采血套数 20 2.采血量 成人：推荐每个血培养瓶应加的血量为 8 10ml， 血液和肉汤比为 1： 5 10（体积 /体积）。 儿童：因很难获得大量的血液，一般静脉采血 3 5ml 用于血培养。 血液量太多或太少都不利于细菌的检出，血液的 培养量每增加 1ml,阳性率增加 3 5。 骨髓采量一般为 1 2ml。 人体血液内包含各种抑制细菌生长的因子或抗生 素，注入血液太多可能会抑制细菌的生长。 3.标本的保存 接种标本后立即送检，如不能立即送检，室温 保存，但不能超过 12小时。且勿冷藏。因为某 些苛氧菌可在冰箱温度中死亡，而使培养阳性 率下降。在运往实验室的途中如果天气寒冷， 应采取一定的保温措施。 23 0 30 60 Time (min) 血培养采血时机 细菌浓度 Temp 体温 24 采血时间 一般在发热初期和高峰期采集 对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到 来之前 0.5 1h 采血 最好在未应用抗生素之前采血 若已应用抗生素，应在下次应用抗生素前采 血 静脉导管 1、从病人体内拔出静脉插管，用无菌技术 剪去导管体外部分。（约 5厘米）体内段 导管立即置血琼脂平板上作滚动涂布接 种。不能作床边接种者，将导管置含有 少量生理盐水的无菌试管内送检。 2、也可将剪下的导管体内段置肉汤增菌液 或用于血培养的培养液内，但不能区分 导管感染菌与少量的定植菌。 26 CRBSI的诊断方法 -1 A套 B套 同一 菌 C套 导管血 时间早 于静脉 血 1a + + 是 + 120 分钟 无 是 1b + + 是 + 120 分钟 无 可能是 2 - - + 定植菌污 染菌 3 - - 金葡菌 、念珠 菌 可能是， 加Maki法 证明或重 做 CRBSI静脉血 导管血 其他部位 感染特征 不拔导管情况下判断： 27 CRBSI的诊断方法 -2 拔管情况下判断 培养 菌落 数 1或2套 阳性 + 15 是 1或2套 阳性 - 否 金葡菌 、念珠 菌时不 能否认 2套阴 性 + 不论 多少 否 导管定 植菌 2套阴 性 - 否 血培养 导管Maki法 CRSBI 注解 无菌体液 脑脊液 心包液、胸水、腹水和关节积液 1、浆膜腔积液包括胸水、腹水、心包液、关 节液和鞘膜液等，以严格无菌操作抽取数亳升 液体置无菌试管或小瓶送检。对易自凝的标本 可添加抗凝剂。 2、严格无菌操作下采取脑脊液数毫升于无菌 试管。标本采集后应立即送检，以防细菌死亡 疑似有脑膜炎奈瑟菌时，应注意保暖，不可置 冰箱保存。 也可以取 5ml注入血培养瓶。（引流除外） 31 五、 脓液、穿刺液和引流液 脓液来自身体的多个部位，通常是由各种病原菌 感染产生的浓性渗出液。当发生感染时，液体量 增加。 标本采集 开放脓肿： 首先用无菌盐水清洗病灶表面污染杂菌，用 无菌拭子蘸少许生理盐水，以保持标本湿度， 然后采取脓液及病灶深部的分泌物（最好从脓 肿底部或脓肿壁取样） 开放病灶原则上不做厌氧培养。 32 标本采集 闭锁脓肿 ： 应采集渗出物和脓肿壁标本，不主张用拭子采集 在采集此类标本以前，对患者病灶局部的皮肤或黏膜表面， 用 2.5 3%碘酊消毒、 75%酒精脱碘，用无菌注射器抽取脓 肿内容物，然后切开脓肿、引流，采集的浓汁（大于 1ml）。 深部脓肿常由包括厌氧菌在内的混合细菌感染所致，可同 时作厌氧菌培养 33 34 下呼吸道标本 【 标本送检指征 】 1 咳嗽、咳痰：痰液可为脓性、血性、铁锈色或 红棕色胶胨样痰。 2 咯血：肺结核病人常痰中带血。 3 呼吸困难 4 发热 5 胸痛：当炎症病变累及壁层胸膜时，会发生胸 痛。 肺部感染的患者有 25 50可能发生菌血症，应 同时作血培养。 37 痰标本要求 白细胞（ WBC） 25/LPF 鳞状上皮细胞（ SEC） 10/LPF 否则应重新采样 痰标本要求 38 痰标本 10鳞状上皮细胞 /每 低倍视野 =拒收 有粘液丝的痰标本，且鳞状上 皮细胞很少 =接受 标本采集方法 1 自然咳痰法：晨痰为佳，用温开水漱口数次（为减少 口腔正常菌群污染标本），深咳呼吸道深部痰（非后鼻部 分泌物、非唾液）留于无菌容器内。对于痰量少或无痰的 患者可采用雾化吸入 45 10 NaCL水溶液，使痰液易于 排出。对咳痰少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使 其咳嗽。 2 支气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管 吸引或用支气管刷直接取。 3 胃内采痰法：无自觉症状的肺结核病人尤其婴幼儿不 会咳嗽，有时将痰误咽入胃中，可采集胃内容物做结核分 支杆菌培养。 4 气管穿刺法：主要用于厌氧菌培养 5 小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部， 小儿经压舌刺激咳嗽，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子 上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。 【 注意事项 】 1 晨痰为好。多数病人清晨痰较多，易于采集。 且清晨痰含有的病理成分较多，会增加培养的 阳性率。 2 有 1/4-1/2肺部感染患者可能发生菌血症， 应同时作血培养。 3 能在抗菌药物应用之前采集标本，标本采 集后应立即送检，否则可暂存于 4 冰箱。 4 标本 1ml 5痰标本每天送一次、连续 3次；不建议 24h内 多次采集，除非痰液外观性状出现改变。 上呼吸道标本 标本送检指征 1 病毒性普通感冒伴有明显咽痛时，怀疑为 咽部链球菌感染，应做细菌培养。 2 细菌性咽扁桃体炎：明显咽痛、畏寒、 发热，体温可达 39 以上。 3 上呼吸道感染易并发鼻窦炎、中耳炎、气管 支气管炎，需送相应部位分泌物或痰液进行 细菌培养。 标本的采集方法 嘱患者先用清水漱口，由检查者将其舌外拉使 悬雍垂尽可能向外牵引 , 用压舌板将舌向下向 外压，用无菌棉拭子越过舌根到咽后壁或悬雍 垂的后侧 ,反复擦拭数次然后送检，拭子应避 免触及舌、口腔粘膜和唾液。 尿液标本 标本送检指征 1 有典型的尿路感染症状； 2 肉眼脓尿或血尿； 3 尿常规检查表现为白细胞和 /或亚硝酸盐阳性； 4 不明原因的发热，无其他局部症状； 5 留置导尿管的病人出现发热； 6 膀胱排空功能受损； 7 泌尿系统疾病手术前。 标本的采集方法 1 清洁中段尿标本，晨尿为佳，嘱咐患者睡前少饮水，保 证与上次排尿时间间隔 4小时以上。女性采样前用清水冲 洗外阴部及尿道口，男性须翻转包皮冲洗，用清水冲洗尿 道口，然后收集标本，方法是排尿弃去前段尿，无中断尿 流时收集 10ml中段尿于无菌容器内送检。于一小时内接种。 该方法简单、易行，是最常用的尿培养标本收集方法，但 很容易受到会阴部细菌污染，应由医护人员采集或在医护 人员指导下由患者正确留取。 2 耻骨上膀胱穿刺：使用无菌注射器直接从耻骨上经皮穿 入膀胱吸取尿液，是 评估膀胱内细菌感染的 “金标准 ”方法 ， 但有一定的痛苦，病人难以接受。主要用于厌氧菌培养或 留取标本困难的婴儿尿标本的采集。 3 直接导尿：按常规方法对会阴部进行清洗消毒后，用导 尿管直接经尿道插入膀胱，获取膀胱尿液。可减少尿液标 本的污染，准确地反映膀胱感染情况。但有可能将下尿道 的细菌引入膀胱，导致继发感染，一般不提倡使用。 4 小儿收集包：对于无控制能力的小儿可应用收集包收 集尿液，这种装置由于很难避免会阴部菌群污染产生假阳 性，所以只有在检验结果为阴性时才有意义。如果检验结 果为阳性，应结合临床进行分析，必要时可使用耻骨上膀 胱穿刺或导尿法留取尿液进行复查。 5 留置导尿管收集尿液：利用留置导尿管采集标本时， 应先消毒导尿管外部，按无菌操作方法用注射器穿刺导尿 管吸取尿液，操作时应防止混入消毒剂，不能从收集袋中 采集尿液。长期留置导尿患者，应在更换新尿管时留取尿 标本。 6 集尿法：尿查抗酸杆菌时，留 24小时尿液盛于洁净容 器内，取其沉渣 10mL送检。 标本采集注意事项 1 通常取清晨第一次尿液送检。 2 多数药物均通过尿液排泄，因此，无论用何 种方法采集尿液均宜在用药之前进行细菌培养。 3 尿培养不得加防腐剂或消毒剂。 4 标本采集后应立即送检，否则可暂存于 4 冰 箱。 大便标本 【 标本送检指征 】 1 急性腹泻：大便次数明显增多，腹痛，里急后重，往 往伴有发热，大便性状为粘液便或脓血便。 2 慢性腹泻：大便次数多，多为稀便，伴有全身乏力等 症状。 3 无痛性大量水样便或米泔样稀便。 4 先吐后泻：恶心、呕吐、腹痛、腹泻。有集体发病史， 多为细菌性食物中毒所致。 5 抗生素治疗后腹泻：常发生于长期抗生素治疗后，糊 状便，排便次数增加。 6 高热惊厥：通常为中毒性痢疾，多见于婴幼儿和小儿。 标本的采集方法 1 自然排便采集法：自然排便后，挑取有脓血、 粘液部位的粪便 2-3g，液状粪便取絮状物 1 3ml盛于无菌的容器中送检。 2 直肠拭子法：适于排便困难者或婴幼儿。可用 肥皂水将肛门周围洗净，用无菌盐水、保存液 或增菌液湿润的无菌棉拭子插入肛门 ,成人约 4 5cm，儿童约 2 3cm，与直肠粘膜表面接 触，轻轻转动 ,放灭菌试管内送检。 生殖道标本 应根据感染的部位和可能的病原体决定用于病 原学诊断的标本种类、采集部位和采集方法等。 由于正常菌群的存在，所以在采集女性生殖道 标本时应注意尽量减少和避免正常菌群的污染。 1、生殖器溃疡标本：用无菌盐水清洗溃疡面并用无菌手 术刀清除坏死组织和覆盖的分泌物，暴露出溃疡基底；待 渗出物积聚较明显时，轻压溃疡基地并用拭子或吸管采集 渗出物；疑有肉芽肿荚膜杆菌感染时可在溃疡边缘取肉芽 肿组织标本。 2、宫颈标本：用无菌生理盐水湿润窥阴器（不用润滑油） 暴露宫颈；用拭子清除阴道和宫颈局部分泌物，弃拭子； 轻压宫颈以使宫颈分泌物流出，用拭子采集分泌物或用专 用拭子插入宫颈内口 1 2cm，旋转数周后停留 20s，以充 分吸附分泌物，拔出拭子，注意不要将拭子接触阴道壁。 3、阴道标本：先用拭子清除阴道表面分泌物，弃拭子； 在后穹窿或阴道上端用无菌拭子或吸管采集粘膜分泌物； B群链球菌筛查培养应在阴道口（和 /或直肠肛门部位）采 集拭子标本。 4、子宫内膜标本：用无菌生理盐水湿润窥阴器（不用润 滑油）；用拭子清除阴道和宫颈局部分泌物，弃拭子；用 双腔的真空吸引器吸取标本或用拭子取子宫内膜标本，注 意防止宫颈和阴道正常菌群的污染。 5、腹腔炎性渗出物标本：通过后穹隆穿刺术获得；亦可 直接在手术过程中获得。 6、前庭大腺标本：用碘伏等无刺激性消毒液消毒皮肤； 急性感染用拭子采取腺管分泌物；脓肿形成时，用注射器 吸取脓液。 7、尿道分泌物：标本采集应最少在病人排尿 1h后进行， 先用无菌拭子清除尿道口分泌物，用另一无菌拭子采集尿 道分泌物，分泌物过少时女性可经阴道按摩尿道，男性可 从阴茎的腹面向龟头方向按摩，使分泌物溢出。如不能获 得尿道分泌物，可将尿道拭子插入尿道约 2cm左右，轻轻 转动后取出。 8、前列腺液：采用 Stamey Test，即被检者检查前 1周内 停服抗生素，外阴消毒后，留取排出的首段尿液 10ml为 VB1（首次膀胱尿标本），继续排尿 200ml后，留取 10ml 尿液为 VB2（第二份膀胱中段尿标本），即行前列腺按摩， 收集按摩液为 EPS，随之立即排尿，收集首段尿液 10ml为 VB3。 4份标本均送细菌培养、菌落计数和药敏试验。 9、做淋菌培养标本应立即送检或床旁接种，勿放冰箱保 存。淋病奈瑟菌感染如能同时采集直肠标本会增加阳性率， 其采集方法为将拭子插入肛管 2.5cm左右，穿过肛门括约 肌后转动拭子，停留 10 30s，取出的粪便标本不能有粪 便污染。如有尿道症状时可采集尿道分泌物。 厌氧培养 厌氧菌培养采集标本必须避免正常厌氧菌群的污染，更重要的是必须避 免与氧接触致厌氧菌死亡。 1.无菌体液：严格无菌技术采集标本，无菌体液包括血液、胸腔积液、关 节液、心包液、胆汁、脑脊液、腹腔液、和膀胱穿刺液等。采取标本时 应尽量避免接触空气，多使用针管抽取，减少标本与空气接触的机会。 抽取时穿刺针头应准确插入病变部位的深处，一般抽取数毫升。抽出后 可排出一滴标本于酒精棉球上。若病灶处的标本量较少，则可以先用针 筒吸取 1 ml 还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。标本采集后， 将针头插入无菌橡皮塞或用专用培养基立即送检，。 2.肺部 : 下呼吸道分泌物肺穿刺术或用带有保护套的纤支镜采取。 3.脓肿：封闭性脓肿采用针管抽取；如已破溃，用无菌棉拭子擦去表面脓 液，取深部分泌物。 4.窦道或深部创伤：用空针连着静脉注射的塑料导管穿感染部位抽吸。 5.尿道：用无菌注射器直接从耻骨上缘行膀胱穿刺术抽取，将针头插入无 菌橡皮塞内送检。 条件致病菌的判断标准 1、有炎症反应（有吞噬 、 浸润现象） 2、长期大量存在 3、与临床转归是否一致 注：可做 G-试验，内毒素测定， PCT等辅助诊断 57 没有好质量的标本，实验室采取任何先进 的分离、鉴定和药敏技术都是无济于事的。 因此，正确、规范的采集标本是保证临床 微生物学检验质量的最重要的前提。 抓住时机、选好部位、防止污染、及时送 检 结 束 语 谢谢！ 细菌