21微生物的实验室培养2

课题1 微生物的实验室培养1.提供营养和条件2.防止污染微生物的类群微生物的类群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞(1)根据你所掌握的知识，分析导致生产失败的根据你所掌握的知识，分析导致生产失败的根源是什么根源是什么?(2)由此可见，研究和应用微生物的前提是什由此可见，研究和应用微生物的前提是什么？么？根源在于发酵物中混入了杂菌根源在于发酵物中混入了杂菌 防止杂菌入侵，获得防止杂菌入侵，获得纯净的培养物纯净的培养物 一、培养基一、培养基微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：含注：含CHONCHON的的有机物有机物是是异异养型微生物的养型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源一、培养基一、培养基微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：含注：含CHONCHON的的有机物有机物是是异异养型微生物的养型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐2.2.特殊营养：特殊营养：维生素、碱基等维生素、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧气的需求：、氧气的需求：4.4.种类：种类：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产化学成分：化学成分：物理性质：物理性质：天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基一、培养基一、培养基划分标准划分标准培养基种类培养基种类特点特点用途用途物理性质物理性质化学成分化学成分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基用途用途鉴别鉴别培养基培养基培养基的种类培养基的种类不加凝固剂不加凝固剂加凝固剂，如琼脂加凝固剂，如琼脂工业生产工业生产微生物分离、鉴定、微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌活菌计数、保藏菌种种含化学成分不明确的天然物质含化学成分不明确的天然物质工业生产工业生产培养基成分明确培养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质质,以抑制不需要的微生物以抑制不需要的微生物的生长的生长,促进所需要的微生促进所需要的微生物的生长物的生长培养、分离出特培养、分离出特定微生物定微生物在培养基中加入某种指示剂在培养基中加入某种指示剂或化学药品或化学药品,用以鉴别不同用以鉴别不同种类的微生物种类的微生物鉴别不同种类微鉴别不同种类微生物生物选择培养基选择培养基液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:几种选择培养基举例：几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离固氮菌 分离自养型微生物分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌分解纤维素的细菌牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g分析营养构成？分析营养构成？5.5.配制原则配制原则目的明确：目的明确：营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料自养型：自养型：不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化方法，的理化方法，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa、121、1530min防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：二、无菌技术二、无菌技术请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台四、大肠杆菌的纯化培养四、大肠杆菌的纯化培养分散成单个细胞分散成单个细胞,形成单个菌落形成单个菌落3.3.功能：功能：单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体1.1.定义：定义：1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）四、大肠杆菌的纯化培养四、大肠杆菌的纯化培养平板划线时不能划破培养基，为什么？平板划线时不能划破培养基，为什么？一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。个条状的菌落。1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。环境和感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？上一次划线的末端开始划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。繁殖而来的菌落。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍平板划线法：平板划线法：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录四、大肠杆菌的纯化培养四、大肠杆菌的纯化培养五、课题成果评价五、课题成果评价 培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同（一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录1.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020六、课题延伸（菌种的保藏）六、课题延伸（菌种的保藏）本课题知识小结本课题知识小结微生物的实验室培养微生物的实验室培养培养基培养基无菌技术无菌技术制备牛肉蛋白胨固制备牛肉蛋白胨固体培养基体培养基纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌结果分析与评价结果分析与评价培养基的类型培养基的类型培养基的营养物质培养基的营养物质避免杂菌污染的方法避免杂菌污染的方法实验室常用的消毒方法实验室常用的消毒方法实验室常用的灭菌方法实验室常用的灭菌方法平板划线法平板划线法稀释涂布法稀释涂布法（步骤）（步骤）编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100m100ml l例例3 3右表是某微生物右表是某微生物培养基成分，请据此回培养基成分，请据此回答：答：（1 1）右表培养基可培）右表培养基可培养的微生物类型养的微生物类型是是 。（2 2）若不慎将过量）若不慎将过量NaClNaCl加入培养基中。加入培养基中。如不想浪费此培养基，如不想浪费此培养基，可再加入可再加入 。自养型微生物自养型微生物 含碳有机物含碳有机物（3 3）若除去成分）若除去成分，加（，加（CH2OCH2O），），该培养基可用于培养该培养基可用于培养 。（4 4）表中营养成分共有）表中营养成分共有 类。类。（5 5）不论何种培养基，在各种成分都）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是溶化后分装前，要进行是 。（6 6）右表中各成分重量确定的原则）右表中各成分重量确定的原则是是 。（7 7）若右表培养基用于菌种鉴定，应）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是该增加的成分是 。固氮微生物固氮微生物 3 调整调整pHpH 依微生物的生长需要确定依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）