淀粉酶活性测定实验报告

号：03淀粉酶活性的测定一、研究背景及目的酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的 生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角 色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数， 反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由 酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生 成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的 作用方式，可分为a-淀粉酶和B-淀粉酶等a-淀粉酶和B-淀粉 酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。8-淀粉酶存在于 休眠的种子中，而a-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。a-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标，a-淀粉酶活性 低的品种抗穗发芽，反之则易穗发芽。目前，关于a-淀粉酶活性的测 定方法很多种，活力单位的定义也各不相同，国内外测定a-淀粉酶活 性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ，5-二硝基水杨酸比色法和降落值 法 。这 3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉，获得的a-淀粉酶活性应该分别是延迟（内源）a-淀粉酶、萌动种子 a-淀粉酶和后熟面粉的a-淀粉酶活性。测定方法优点缺点DNS灵敏、准确、精确度高, 适宜精确测量小样品 a -淀粉酶活性大小测定步骤较繁，不便分析大量样品，测定范围较窄凝胶扩散法简便、快速、省时、省 力，消耗材料和药品较 少，不需要特殊仪器， 测定范围较宽边界不清晰，灵敏度与 准确度较低，不适宜精 确测量a-淀粉酶活性 的大小降落值法快速、省时、重现性好、 平行性好、消耗的药品 少，适宜于测量大量样 品消耗的材料多，间接测 定a-淀粉酶活性大小本实验的目的在于掌握a-淀粉酶和淀粉酶的提取和测定方法。二、实验原理萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是a-淀粉酶和B-淀粉酶，B-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而a-淀粉酶不耐酸，在下则发 生钝化。本实验的设计利用B-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70C） 下处理使得B-淀粉酶钝化而测定a-淀粉酶的酶活性。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦 芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用 3,5-二硝 基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的 显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含 量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然 后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促 反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实 验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用 过程中，四支测定管及空白管不要混淆。三、材料、试剂与仪器实验材料：萌发的小麦种子（芽长1 厘米左右） 仪器：722光栅分光光度计（编号990695）DK-S24型电热恒温水浴锅（编号L-304056）离心机（TDL-40B）容量瓶：50ml X1, 100ml X1小台秤研钵具塞刻度试管：15mlX6试管：8支移液器烧杯试剂： 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解, 冷却后定容至100ml ）; 的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液、B液混匀即为柠檬酸缓冲液; 3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50mI蒸馏水，再加入30克酒石酸钠， 待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）； 麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； 0.4M NaOH四、实验步骤1. 酶液的制备称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆， 转移到50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，混匀后在室温下放置， 每隔数分钟振荡一次，提取15-20分钟，于3500转/分离心20分钟， 取上清液备用。2. a-淀粉酶活性的测定 取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管 于每管中各加酶提取液液1ml,在70C恒温水浴中（水浴温 度的变化不应超过0.5C ）准确加热15m in,在此期间B-淀粉酶钝 化，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。 在试管中各加入1ml柠檬酸缓冲液 向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH,以钝化酶的活性 将测定管和对照管置于40C(0.5C)恒温水浴中准确保 温15mi n再向各管分别加入40C下预热的淀粉溶液2ml,摇匀，立即 放入40C水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速加入 4ml 0.4M NaOH,以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。3. 两种淀粉酶总活性的测定取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度(稀释倍数 视样品酶活性大小而定,一般为20倍) 。混合均匀后,取4支管,注 明2支为对照管，另2支为测定管，各管加入1ml稀释后的酶液及柠 檬酸缓冲液1ml,以下步骤重复a-淀粉酶测定的第及第的操作。4. 麦芽糖的测定标准曲线的制作取 15ml 具塞试管 7 支,编号,分别加入麦芽糖标准液 (1mg/ml)0、毫升，用蒸馏水补充至，摇匀后再加入3, 5-二 硝基水杨酸1ml,摇匀，沸水浴中准确保温5min,取出冷却，用蒸馏 水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录消 光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。样品的测定取 15ml 具塞试管 8 支，编号，分别加入步骤 2 和 3 中各管的溶 液各1ml,再加入3, 5-二硝基水杨酸1ml,摇匀，沸水浴中准确煮 沸5min,取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于 520nm波长下比色，记录消光值，根据标准曲线进行结果计算。五、数据整理及计算均值0D520样品麦芽糖浓度mg/ml上表中前 4 行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制 标准曲线（见下页），计算上表中第 4 行数据（各样品的 OD 值）均值 填入上第 5 行中，根据标准曲线的方程，计算第5 行 OD 值所对应的 麦芽糖浓度，填入最后一行，如上表。（AA ）x样品稀释总体积样品重（g）x 5根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：（B B ）x样品稀释总体积样品重（g）x 5a -淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）二（a -+B-）淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-i鲜重分钟-1）二Aa -淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A a-淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度B（a-+B -）淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B （ a -+ B -）淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度计算结果如下：a-淀粉酶活性二（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1)(a-+B-)淀粉酶活性二(毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1)淀粉酶活性二 (毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-J六、结果分析七、思考题1、酶活力测定实验的总体设计思路是什么实验设计的关键你认为是 什么为什么答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶 活性，通过测酶促反应的产率推算酶活力大小。关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或避免其 它酶产物给测定结果带来的误差。2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是哪些步骤为什么 怎样的操作策略可以尽量减少误差答：浸提步骤。70C温度或15min时间控制不严格不准确则可能导 致B淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。 70C水浴后需要立即冰浴，否则B淀粉酶复性使测得a淀粉酶活性结 果偏大。向测定管中加入NaOH时应迅速，否则酶与底物继续反应 使结果偏大。3、-淀粉酶活性测定时70C水浴为何要严格保温15分钟保温后为 何要立即于冰浴中骤冷答：由于 -淀粉酶不耐热，在70C下处理一定时间可以钝化，严格 保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，-淀粉酶活性也 会受到影响；时间不足， -淀粉酶钝化不完全。保温后立即骤冷是 为了通过剧烈的温变改变 -淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复 性，这样就保证了在随后的40C温浴的酶促反应中-淀粉酶不会再 参与催化反应。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处 理时间的长短。4、柠檬酸缓冲液的作用各管于40C水浴准确保温15分钟的作用答：酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全 失活。加入的缓冲液调至酶促反应的最适pH，同时稳定溶液的pH不 至于在反应过程中大幅波动。40C水浴准确保温15分钟为调整酶促反应的最适温度5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化 -淀粉酶的活 力而测 -淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化 -淀粉酶活 力去测 -淀粉酶活力呢这种设计思路说明什么答：B淀粉酶与a淀粉酶的催化特性是有差异的。B淀粉酶主要作用 于直链淀粉的a-1, 4-糖苷键，而且仅从淀粉分子外围的非还原性末 端开始，切断至a -1,6-键的前面反应就停止了；而a淀粉酶则无差 别地作用于直链淀粉与支链淀粉的a-1, 4-糖苷键，所以B淀粉酶需 要a淀粉酶淀粉支链的a-1, 4-糖苷键后才能完全体现其催化能力。此外我认为在实验中温度比酸度更易控制，钝化a淀粉酶难度远远高 于B淀粉酶，而且若提高酸度钝化a淀粉酶，则回调最适pH时a淀 粉酶也有可能由于复性恢复活力。这种设计思路说明在测定酶的比活力时要综合考虑各种可能出现的 酶的性质以及它们之间的联系，也要考虑到实验操作的可行性。6、本实验中所设置的对照管的作用它与比色法测定物质含量实验中 设置的空白管有何异同本实验可否用对照管调分光光度计的100%T 为什么答：消除非酶促反应（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内 的酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差。两种都是为了消除非测定部分对光的吸收，空白组是为了消除溶液中 溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反应所 得的多余溶质对光的吸收。不可，因为标准曲线的确定是在空白的基础上的，得到的是0D值与 麦芽糖含量的关系7、我们所测定得到的总酶活力减去所测定得到的 -淀粉酶活力是否 就等于-淀粉酶活力为什么你的结论说明什么答：不等于。因为B淀粉酶和a淀粉酶作用于a-1,4糖苷键，但二者都不能水解支链的a-1, 6-糖苷键，而我们所测定得到的总酶活力 是二者在与R酶的共同作用下测得的酶活力，R酶能够降解支链淀粉, 断裂a-1,6-糖苷键，从而增大了 B淀粉酶和a淀粉酶可水解的底物 浓度，使测得的总活力大于B淀粉酶和a淀粉酶单独作用的酶活力之 和。我的结论说明实验时要考虑各种酶协同作用的综合因素七、参考文献1 生物化学实验指导中国农业大学生物化学实验室 中国农业大学自编教材2 基础生物化学赵武玲中国农业大学出版社3 岳海凤i ,2 ,郜庆炉2,薛香2小麦a-淀粉酶活性测定方法比较（ 1 .河南农业大学, 河南郑州 450002 ; 2.河南科技学 院, 河南新乡 453003）4 百度百科 淀粉酶艾志录等 不同品种小麦发芽过程中淀粉酶活 力变化规律的研究中国粮油学报 2006年6月第21卷第3期6马永强等 玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究 食品科学294297， 2007, Vol. 28, No. 11