生物制药毕业论文

常州工程职业技术学院毕业设计（论文）常州工程职业技术学院毕业设计报告（论文）（ 2011 届） 课题名称： 指导教师： 班 级： 学生姓名： 摘 要乳酸菌是一类以糖为原料，主要产物为乳酸的细菌的总称，其重要性已经引起国内外的广泛关注。乳酸菌产生的具有抑菌作用的物质细菌素，具有无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境等优点，已成为生物食品防腐研究的重点，并被认为是最有效的抗生素替代物。乳酸菌在医疗、生物防治、食品、饲料和发酵等领域也具有广泛的应用前景。本文主要以市售进口奶酪为研究对象，采用BCG培养基分离出单个的细菌菌落，通过观察菌落形态、菌体形态观察筛选出5株乳酸菌，通过抑菌实验，在5株乳酸菌中筛选得到1株具有高抑致病菌活性的乳酸菌菌株GL5，通过菌株形态学特征的观察与生理生化特征的鉴定，参考伯杰细菌鉴定手册，该菌株与干酪乳杆菌最相似。关键词：乳酸菌；抑菌；鉴定 IVAbstractsLactic acid bacteria is a kind of the umbrella name taking that candy is raw material, main outcome as the lactic acid bacterium, its significance already arouses broad home and abroad attention. Having that the Lactic acid bacteria produces or the bacterium effect matter bacterium is plain, innocuous, there is no the side effect, the nothing being left over, there is no resistance to drugs, the environment contaminating at the same time neither waits for merit, already becomes the priority that living things food antisepsis studies, and is regarded as the most effective antibiotic substituent. Lactic acid bacteria is in medical treatment, biological control, food, fields such as feed and fermentation also have the broad application prospect. The BCG medium was used to isolate the single conlony from the cheese in the supermarket. Five kinds of lactic acid bacteria were screened based on the morphological characteristics, and according to the bacteriostatic experiment, GL5 from cheese had the highest bacteriostatic activity. GL5 was homologous with Lactobacillus casei based on the morphological ,physiological characteristics and Bergeys manual of determinative bacteriology.Key words：Lactic acid bacteria, bactriostasis, indentification 目 录摘 要.Abstracts.目 录.第1章 前 言.11.1乳酸菌的生理功能.11.2乳酸菌的类型. .21.3乳酸菌的研究历史.21.4乳酸菌的工业用途.21.5乳酸菌细菌素.2第2章 材料与方法.42.1 材料.42.2 方法.5第3章 结果与分析.93.1抑菌实验结果.93.2抑菌物质的确定.93.3乳酸菌的鉴定.10第4章 结论.134.1分离纯化结果. 134.2抑菌试验的结果. 13 4.3鉴定结果. 13致谢. .14参考文献.15常州工程职业技术学院毕业设计（论文）第1章 前言乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。 1. 1 乳酸菌的生理功能在人体肠道内栖息着数百种的细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康有益的叫益生菌，以乳酸菌、双歧杆菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肝杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等为代表。益生菌是一个庞大的菌群，有害菌也是一个不小的菌群，当益生菌占优势时（占总数的80%以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健康或非健康状态。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。 而人体肠道内乳酸菌拥有的数量，随着人的年龄增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。现在，由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的危胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。目前国际上公认的乳酸菌，被认为是最安全的菌种，也是最具代表性的肠内益生菌，人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫“长寿学说”里所得出的结论，乳酸菌=益生菌=长寿菌。 乳酸菌的生理功能1具体有：1、防治有色人种普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。 2、促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。 3、使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。4、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。5、抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。6、免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力。7、抗肿瘤、预防癌症作用。8、提高SOD酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。9、有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。1.2 乳酸菌的类型乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌。因为动物源取自动物，因菌种常处于相对不稳定状态，其生物功效也较不稳定，且在大量食用时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。而植物源乳酸菌，因为取自植物易被人体认可，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥其强大而稳定的生物功效。 1.3 乳酸菌的研究历史 早在20世纪初，俄国著名的生物学家梅契尼柯夫（Mechnikoff,1845-1916），在他获得诺贝尔奖的“长寿学说”里已明确指出，保加利亚的巴尔干岛地区居民，日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌，这些乳酸菌能够定植在人体内，有效地抑制有害菌的生长，减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害，这是保加利亚地区居民长寿的重要原因。这个具有划时代意义的“长寿学说”，为人类利用乳酸菌生产健康食品开创了新纪元。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。 早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。到目前为止，人类日常食用的泡菜、酸奶、酱油、豆豉等，都是应用乳酸菌这种原始而简单的随机天然发酵的代谢产物。1.4 乳酸菌的工业用途乳酸菌多数为同型发酵，如链球菌属（Streptococcus），是与人类关系密切的重要菌群，有些菌是人和温血动物的致病菌；有些是人体的正常菌群存在于口腔和肠道；有些是乳制品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用，如乳链球菌（Slactis）。少数为异型发酵，如肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是制药工业上生产右旋糖酐（即代血浆）的重要菌种，但也是制糖工业的一种有害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工。 1.5 乳酸菌细菌素乳酸杆菌在胃肠道内能够产生细菌素，抑制病原菌的作用，而且乳酸杆菌属的细菌都是无毒副作用的，因此是一类很有前途的益生素生产菌种(Ewing和Cole,1994)。乳酸菌是正常人畜肠道中极为重要的生理菌群，担负着人畜机体多种重要的生理功能，具有维持人体中微生态平衡作用。而且，乳酸菌能够产生有机酸(如乳酸、丁酸和醋酸等)、过氧化氢和细菌素等抑菌物质1。这些抑菌物质不仅不破坏食品的风味和组织状态，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保藏期。乳酸菌产生的细菌素以其对动物无毒性，易被人体消化道中的蛋白酶降解，不会在体内蓄积引起不良反应等特性，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂2。本实验欲从进口干酪中分离乳酸菌，并研究各种乳酸菌对食品中常见致病菌的抑制作用。由于乳酸菌来源于食品,其无毒副作用、无残留、无抗药性等优点受到人们的关注。乳酸菌在发酵过程中可以产生一系列物质,能够抑制或杀死一些食物腐败菌,其中起主要抑菌作用的是细菌素,其具有一定的热稳定性,易被人体消化道的部分蛋白酶降解,并且不会在体内积蓄引起不良反应。因此，乳酸菌制剂作为一种天然防腐保鲜剂，有着广阔的市场前景。第2章 材料与方法2.1 材料2.1.1 样品市售进口奶酪2.1.2 培养基1、BCG培养基：A、B液灭菌后混匀。A液：脱脂奶粉50g,1.6%溴甲酚绿酒精液0.35ml,蒸馏水250ml.(90，开盖灭菌10min)B液：酵母膏5g,琼脂10g,蒸馏水250ml。(PH 6.8 , 121灭菌20min) A、B液灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板。2、MRS 液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵1.45g、K2HPO4H2O 2.6g、MgSO47H2O 0.58g、MnSO44H2O 0.25g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000mL。(PH 6.26.4 , 121 , 灭菌20min)。3、PY培养基（100mL）：蛋白胨1.0g，酵母提取物1.0g，无机盐溶液4.0mL（盐溶液成分:无水CaCl2 0.2g，MgSO4 20.0g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g，将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中，再加500mL蒸馏水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类，继续搅拌直到全部溶解，加蒸馏水定容至1000mL，混合后贮备于4)。4、PYG培养基：PY在基础培养液内加入1.0g葡萄糖。5、SS培养基：牛肉粉5g、月示胨5g、三号胆盐8.5、枸橼酸钠8.5g、乳糖10g、枸橼酸铁1g、硫代硫酸钠8.5g、中性红0.025g、煌绿0.00033g、琼脂17g、蒸馏水1000mL。2.1.3 指示菌种单增李斯特菌（Listeria monocytogens）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、大肠杆菌（Escherichia coli）：均购于广东微生物菌种保藏中心。2.1.4 试剂脱脂奶粉：光明乳业股份有限公司；1.6%溴甲酚绿酒精溶液：自配；琼脂：生化试剂,福建泉州市泉港化工厂；酵母膏：生化试剂,原上海酵母厂；蛋白胨：生化试剂,上海化学试剂采购供应站中心化工厂；牛肉膏：生化试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖：分析纯试剂,国药集团化学试剂有限公司；乙酸钠：分析纯试剂,成都科龙化工试剂厂；柠檬酸三铵：分析纯试剂,上海试四赫维化工有限公司；磷酸氢二钾：分析纯试剂,上海光铧科技有限公司；MgSO47H2O：分析纯试剂,上海美兴化工有限公司；MnSO44H2O：分析纯试剂,上海美兴化工有限公司；吐温80（聚山梨酯-80）：分析纯试剂,上海申宇医药化工有限公司。2.1.5 仪器和设备LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SHP-150恒温培养箱：上海山连实验设备有限公司；电子显微镜：上海欣茂仪器有限公司；CA-1390-1垂直层流洁净工作台：上海上净净化设备有限公司；电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；FL-1可调式封闭式电炉：北京市永光明医疗仪器厂；GL-21M高速冷冻离心机：上海市离心机械研究所有限公司；其他器材：烧杯、玻璃棒、吸量管、洗耳球、胶头滴管、涂布棒、试管等。2.2方法2.2.1 样品的处理奶酪的处理：以无菌操作取奶酪1g，放入含有9mL灭菌加热至含40左右的生理盐水的灭菌广口瓶内，待奶酪溶解制成1:10的均匀稀释液，并用无菌生理盐水逐级稀释至10-3、10-4、10-5。2.2.2 乳酸菌的分离纯化采用BCG牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化。以无菌操作取奶酪稀释液10-3、10-4、10-5 各0.1mL置于灭菌后的平板中，加入15mL BCG牛乳培养基，带培养基凝固后放入恒温培养箱中，37恒温培养24h。观察结果稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌3。2.2.3 革兰氏染色洗片载玻片上滴一滴蒸馏水玻璃棒蘸取一滴菌液在玻片上晾干结晶紫初染1min水洗晾干碘液媒染30s水洗晾干95%酒精脱色20s水洗晾干番红复染水洗晾干镜检。2.2.4 菌种的扩大培养配制MRS液体培养基，分装到试管中(每管约15mL),将选出的菌种接种到试管中在37条件下扩大培养24h，在接种到小三角瓶中扩大培养24h。2.2.5 乳酸菌的抑菌实验-管碟法a) 将扩大培养的菌液进行离心(条件: 10000r/min,10min)；b) 在培养皿中加入约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基；c) 待第一层培养基冷却后，加入混有致病菌的培养基约15ml；d) 待培养基冷却后，加入牛津杯进行固定；e) 在牛津杯中加入菌液及无菌水进行对照(等边三角形)；f) 将培养基放入培养箱中进行培养(条件:37,24h)。 2.2.6 抑菌物质的确定2.2.6.1酸对乳酸菌抑菌活性的影响初筛菌株的发酵上清液，用1mol/L NaOH溶液调节pH值为6.5或用乳酸调节改良MRS液体培养基pH值与发酵上清液的pH值相同，参照抑菌试验所述方法作抑菌活性对比。2.2.6.2过氧化氢对乳酸菌抑菌活性的影响过氧化氢酶溶解在50mmol /L 的磷酸缓冲液( pH=7.0 )中配成母液,加入到发酵液中使过氧化氢酶的终浓度为5mg/mL,在37水浴中温育2h后取出,检测过氧化氢酶处理后发酵液的抑菌活性。2.2.6.3酶对发酵上清液抑菌效果的影响筛选菌株发酵上清液分别用1mg/mL的蛋白酶K、胰蛋白酶处理（37、1h），然后进行抑菌试验，同时设未经酶处理的发酵上清液作为对照。2.2.7：乳酸菌的鉴定乳酸菌的鉴定包括形态学观察和生理生化实验，具体参见根据伯杰细菌鉴定手册（第八版）与乳酸细菌分类鉴定与实验方法。2.2.7.1 形态学观察挑选出产抑菌物质的菌株，在合适的培养基上划线培养24h，待长出单菌落观察其菌落特征，并进行革兰染色，在光学显微镜下观察其观察菌体形状、排列方式、有无芽孢等个体形态特征、菌体革兰染色结果。2.2.7.2 生理生化实验1、过氧化氢酶测定将实验菌接种于PYG培养基斜面上，37培养20h24h，取一环接种的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加3%15%的过氧化氢，有气泡则为阳性反应，无气泡为阴性反应。2、精氨酸产氨实验接种试验菌于含精氨酸的培养基中，并同时接种于不含精氨酸的培养作为对照。置37培养培养1-3d。取已生长好的培养液少许置于比色盘内，加奈氏试剂数滴，当产氨时出现橙黄或黄褐色沉淀。含精氨酸培养中的培养液与试剂的反应显示强于对照液才能认为是阳性反应。因为有些菌尚能利用培养基中的蛋白胨产氨，二者不可混同。3、明胶液化实验将实验菌接种于基础培养基中，置37培养，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。4、吲哚实验将试验菌接种至蛋白胨水培养基中,37下培养48h以上。在培养液中加入乙醚12mL，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。5、产硫化氢实验将普通滤纸剪成约0.5-0.6cm宽的纸条，长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50100g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘干，放入培养皿或试管内，灭菌后备用。将新鲜试验菌培养物接种于培养液后，用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。试验中设空白对照，在未接种的试管培养上悬挂乙酸铅纸条。另外接种已知菌的阴性反应作对照。置于37培养培养1-3d，进行观察比较，纸条变黑为阳性反应。6、糖发酵实验将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中，分装含5mL培养基的试管。分别取0.2mL鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37培养24h，振荡培养。检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照，滴加试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。2.2.8：乳酸菌的保藏将具有较强抑菌活性的乳酸菌活化培养，并加入一定的保护剂4，在-76 及真空下冻干3 d后，放-20 冰箱贮藏。共14页，第14页第3章 结果与分析3.1 抑菌实验结果通过BCG培养基，从进口奶酪中共筛选出5株乳酸菌。经管碟法抑菌实验验证，从奶酪中分离出的2株乳酸菌（分别命名为GL1和GL5）对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌都有很好的抑制作用，结果见表1。其中，GL5抑菌效果最佳，如图1所示。图1 GL5菌株抑金黄色葡萄球菌实验结果表1 三种乳酸菌对各指示菌的抑菌圈直径（单位：mm）菌株编号金黄色葡萄球菌（G+）单增李斯特菌（G-）阪崎肠杆菌（G-）鼠伤寒沙门氏菌（G-）大肠杆菌（G-）GL118.015.012.513.010.0GL524.011.516.016.014.0各种乳酸菌对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，这种抑制特性可能与细菌之间的同源性有关。3. 2 抑菌物质的确定3. 2.1 酸对乳酸菌抑菌活性的影响在排除酸的作用后, 将GL5发酵液及用酸处理后的发酵液利用管碟法以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌实验，仍有一定的抑菌作用,见表2。表2 GL5原始发酵上清液及调节pH后的抑菌圈大小样品抑菌圈直径(mm)发酵上清原液240调节pH后的发酵液185活率下降百分率（%）2293. 2.2 过氧化氢对乳酸菌抑菌活性的影响乳酸菌在代谢过程中产生的强氧化剂过氧化氢也可以抑制细菌的生长,尤其是抑制G-菌的生长,因此必须排除过氧化氢的干扰5。发酵上清液用过氧化氢酶处理,以未经过氧化氢酶处理的发酵上清液为对照,以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌实验,结果见表3。表3 GL5原始发酵上清液及过氧化氢酶处理后的抑菌圈大小样品抑菌圈直径(mm)发酵上清原液240过氧化氢酶处理后的发酵液220活率下降百分率（%）833. 2.3 酶对发酵上清液抑菌效果的影响在排除有机酸和过氧化氢对指示菌的抑制作用后,为了确定抑菌物质是否具有蛋白质性质,实验用胰蛋白酶、蛋白酶K对发酵液进行处理，用处理后的发酵液作抑菌实验，检测抑菌能力是否降低，实验结果见表4。表4 GL5原始发酵上清液及蛋白酶处理后的抑菌圈大小样品抑菌圈直径(mm)发酵上清原液240胰蛋白酶、蛋白酶K处理后的发酵液130活率下降百分率（%）4583. 3 乳酸菌的鉴定3. 3.1 形态学观察表5 三种乳酸菌的形态特征菌株编号分离源菌落形态菌体形态GL1奶酪菌落直径约1.5-2.5mm,凸起，边缘整齐，乳白色油状G+，杆状，个别弯曲，排列紧密GL5奶酪菌落直径约2mm，光滑，圆形，湿润，乳白色G+，杆状，两端较平，多成链出现图1 GL5菌的革兰氏染色图片3. 3.2 生理生化特征鉴定生理生化特征鉴定主要实验项目包括在不同温度（15、35和45）试验菌种的生长情况，在不同pH值（pH4.5、5.4、9.0）培养基中生长情况，过氧化氢酶实验，运动性检查，明胶液化实验，吲哚实验，硫化氢产生实验，精氨酸产氨实验与糖发酵实验。表6 GL5菌株生理生化试验结果检测项目结果检测项目结果15生长+过氧化氢酶实验-35生长+运动-45生长-明胶液化-在SL培养基上生长（pH5.4）+吲哚实验-在pH4.5生长a+H2S产生-在pH9.0生长a-精氨酸产NH3-a. 在含有2%蔗糖的的张良MRS培养液中。b. “+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。根据菌种的形态特征与生理生化特性，根据参考资料6，7，将GL5初步鉴定为乳杆菌属。接着对GL5菌株进行糖发酵实验，实验结果如表7所示。表7 GL5菌株糖发酵试验结果检测项目结果检测项目结果葡萄糖（产酸）+甘露醇+葡萄糖（产气）-麦芽糖葡萄糖酸盐+蔗糖+半乳糖-核糖+纤维二糖+木糖-甘露糖+阿拉伯糖-果糖+棉籽糖-乳糖山梨醇+松三糖+海藻糖+注：“+，-”同上；表示弱阳性。根据生理生化实验结果，参考资料6，7，经过删选比对，菌株GL5的生理生化特性与干酪乳杆菌最相似。第4章 结论4.1分离纯化结果利用BCG培养基分离出市售干酪中单菌落，经观察菌落形态与革兰氏染色初步判定为乳酸菌。4.2抑菌试验的结果从市售奶酪中分离出的5种乳酸菌分别编号为GL1-GL5 。染色后显微镜观察，均为革兰氏阳性菌，均为杆状菌。通过对5种指示菌进行抑菌试验，通过管碟法抑菌实验筛选出一种来源于进口奶酪的抑致病菌活性较高的乳酸菌GL5。4.3鉴定结果通过形态学观察与生理生化实验，菌株GL5初步鉴定为干酪乳杆菌。参考文献1 杨洁彬，葛兴华乳酸菌生物学基础与应用M北京：中国轻工业出版社，19962 朱小乔，刘通讯极具潜力的天然防腐剂NisinJ食品与发酵工业，2001，27（4）：66-693 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