dna提取个步骤作用原理

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从lkb至200kb以上不等。各种质粒都 是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持 续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上， 随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒 DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质 粒 DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为:当菌体在NaOH 和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能 够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性 而呈絮 状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如， 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等 方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已 可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子 生物学实验室中常用。一、试剂准备1.溶液 I : 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0 )。1M Tris-HClv!-if !supportAnnotations-t1v!-endif- (pH 8.0) 12.5ml, 0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH2O 至 500ml。在 10 lbf/in2 高压灭菌 15min，贮存 于 4C。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所 以说溶液I中葡萄糖是可缺的oEDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属 离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微 生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所 有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工， 只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶 解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒 呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释 制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱 性。 很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在 瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer (双层膜)结构向micelle (微囊)结构 的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌 (不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂 会带来麻烦。3.溶液III：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,力口 ddH2O 至500ml。4 C保存备用。溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的 误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如 2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关 系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然 是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐 发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓 度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl 而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）， 而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离 子置换了 SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大 家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子 置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质 沉淀了，让 v!-if !supportAnnotations-t3v!-endif- 人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一 起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易 被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。1.为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任 意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉 淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分 子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合， 其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙 醇的价格远远比95%乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中 有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。 折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无 水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。2.在用乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.10.25mol/L?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl,使 Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4C离心8000gx7min,弃上清，将沉淀在室温 下晾干。9.沉淀溶于20卩1 TE (含RNase A 20卩g/ml), 37C水浴30min以降解RNA分子，-20C 保存备用。三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。构建目的基因的真核表达载体目的:构建目的基因的真核表达载体历时整整一学期，期间经历了很多挫折,遇到很多问题，也 从中学到很多经验借寒假的时间写了写我一学期构建的经历，把我的一点经验拿出来和大家 分享讨论.分步来说：一.PCR扩增得到目的片段1. 引物的设计与合成：这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最 后一次挑的两个克隆都是上游引物出错(此上游引物40个碱基)，后来和这家引物公司交 涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克 隆，60%的出错率。现在想想，有几点教训：(1) 尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样(2) 选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下 来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾(3) 旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结 果还是错，时间咱耽误不起2. Pfu酶扩增：(1) 扩增效率低的问题：往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3 分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu,总有一家能扩出来;c多设计几对 引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3互补端； d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接teasy中间载体，测序 正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效 率远远高于以 cDNA 为模板。(2) pfu保真性的问题：即使是pfu,也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是 pfu,但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是 一家小公司的pfu,很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可 在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。3cDNA 模板的问题：在 pfu 摸条件这一步往往要耗费大量 cDNA 模板 , 因此在开始要准备足够的 cDNA。 100ul， 200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在一80C放 了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题， RNA的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提 RNA是一件非常痛苦的事情。二. 酶切的问题：用于构建的酶切一定要非常充分！新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴 定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分， 才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是 空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复 从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是 挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装，用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收” 的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。三. PCR产物直接酶切：我设计引物时保护碱基时随意的在酶切位点两侧加上了两三个g或者c的组合，做到后来才 知道加保护碱基也是有说法的，不同的保护碱基会影响酶切的效率。以我随意加上的保护碱 基，理论上酶切效率将极低。但做下来，前后酶切了四条不同的PCR产物，我并没有再这 一步上遇到问题，我一般37C切30到35个小时，酶切效率都不错。可见关于保护碱基的 问题并不是那么绝对。四. 连接：再这一步上我最深刻的教训就是关于做对照的问题。第一次酶切的载体做载体自连的阴性对照，仅长出了几个克隆。为了省事，以后都省去了这 一步。有两周，我连续做了两轮酶切连接筛选，总共挑了三十多个克隆，居然全是空载体！ 这时再补一个载体自连对照，满板子都是菌落。再换两支新酶重新切载体，回收后再自连， 板子上仅有几个菌落。为了省一点小事费了大力气，后悔莫及。从此以后，认认真真做对照。 另外，关于连接，我是用电泳的方法大概确定载体和目的片段浓度，然后一 1： 5 8左右的 比例配连接体系，感觉还不错。五. 粗筛：有很多种方法，我主要用过两种：碱裂解粗提质粒后酶切，费时费力，但准确性高PCR， 简单省事，但易出现假阳性。相比之下，我更倾向于PCR。操作过程中小心一点，尽量避免各克隆之间的污染，我还习 惯于加厚厚一层石蜡油，一般的我还没有遇到假阳性的情况。一个简单载体的构建，我花了整整一学期的时间。做科研的路充满了挑战，考验和艰辛。遇 到问题的时候，和老师师兄师姐同学讨论，到论坛上来查以前的帖子，受益匪浅。谢谢论坛 上的前辈们。把我的一点经验拿出来和大家分享，肯定也有很多不准确不完善的地方。仅供 参考也欢迎讨论