PCR技术的原理及应用.ppt

PCR技术的原理及应用 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5 3 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3 5 解旋酶 解链酶 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5 3 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3 5 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5 AUCGCG 5 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5 3 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3 5 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5 AUCGCG 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1971年 ， Khorana提出：经过 DNA变性 ， 与合适引物杂交 ， 用 DNA聚合酶延伸引 物 ， 并不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因 。 但由于测序和引物合成的困难 ， 以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能 ， 所以 ， Khorana的设想被 人们遗忘了 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1985年 ， 美国 PE-Cetus公司的 Mullis等人发明了聚 合酶链反应 （ PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNA复制 最初采用 E-coli DNA聚合酶进行 PCR， 由于该酶不耐 热 ， 使这一过程耗时 ， 费力 ， 且易出错 耐热 DNA聚合酶的应用使得 PCR能高效率的进行 ， 随 后 PE-Cetus公司推出了第一台 PCR自动化热循环仪 1993年 ， Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 Kary B. Mullis 1989年美国 Science 杂志列 PCR 为十 余项重大科学发明之首 ,比喻 1989年为 PCR爆炸 年 ,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。 生物样品 DNA片段 基 因 诊 断 基 因 治 疗 基 因 工 程 产 品 法 医 学 检 测 人 类 学 研 究 基因组 DNA 获取特定 DNA片段 扩 增 特 定DNA 片 段 DNA聚合酶 引物 引物 M13噬菌体 Sanger的 测序技术 引物 DNA聚合酶 引物 引物 Mullis 的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定 DNA片段 94 变性 50-65 退火 XX 延伸 94 55 37 Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) 酶 活 性(%) 温度 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72 94 55 PCR循环 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的 PCR反应体系 4种 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 各 10 100pmol 模板 DNA 0.1 2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（ min） 温 度 （ ） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复 13步 2530轮 目的 DNA片段 扩增 100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA 变 性 形 成2 条 单 链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（ min） 温 度 （ ） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复 13步 2530轮 目的 DNA片段 扩增 100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA 变 性 形 成2 条 单 链 模板 DNA 95 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95 50 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50 引物 1 引物 2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第 1轮结束 95 第 2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95 5072Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第 2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板 DNA 第 1轮扩增 第 2轮扩增 第 3轮扩增 第 4轮扩增 第 5轮扩增 第 6轮扩增 实时荧光定量 PCR原理 实时荧光定量 PCR的几种方法介绍 实时荧光定量 PCR在医学和科研中的应用 提 纲 在 PCR反应体系中加入 荧光基团 ，利用荧光 信号累积 实时监测 整个 PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量 PCR定义 常 规 PCR技术： 对 PCR扩增反应的 终点产物 进行定量和定性分析。 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检 测。 实时荧光定量 PCR 原理 实时定量 PCR技术： 利用 荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化 ，通过 Ct值和标准曲 线的分析对 起始模板 进行定量分析。 如何对起始模板定量？ 通过 Ct值和标准曲线对 起始模板 进行定量分析 三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、 Ct值 实时荧光定量 PCR 原理 实时荧光定量 PCR 原理 - 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标： 扩增循环数（ Cycle）； 纵坐标： 荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量 PCR 原理 -荧光 阈 值 荧光信号 阈 值 （ threshold ） ： 前 15个循环信号作为荧光本底信号 （ baseline），即 样本的荧光背景值和 阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是 3 15个循 环的荧光信号的标准差的 10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光最高值，同 时要尽量选择进入指数期的最初阶段， 并且保证回归系数大于 0.99 真正的信号 :荧光信号超过域值 实时荧光定量 PCR 原理 -Ct值 Ct值的定义 ： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增 循环次数。 C(t) value 实时荧光定量 PCR 原理 -Ct值的重现性 横轴： PCR反映循环数 纵 轴 ： 荧 光 信 号 量 Ct值的特点 ： 相同模板进行 96次扩增，终点处产物量不 恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量 PCR 原理 - 定量原理 理想的 PCR反应： X=X0*2n 非理想的 PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第 n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 实时荧光定量 PCR 原理 - 定量原理 在扩增产物达到阈值线时 : XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量 . 在阈值线设定以后 ,它是一个常数 ,我们设为 M 方程式 (1)两边同时取对数得 : lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式 (2)得 : lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到 域值 的循环数即 Ct值 就可计算出样品中所含的模板量。 实时荧光定量 PCR 原理 - 标准曲线 模板 DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct值越 小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标 准品可作出标准曲线，根据样品 Ct值，就可以计算出样品中 所含的模板量。 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的 C(t)值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量 PCR原理 绝对定量 25 提 纲 实时荧光定量 PCR原理 实时荧光定量 PCR的几种方法介绍 实时荧光定量 PCR实验设计及应用 实时荧光定量 原理 实时荧光定量 的几种方法介绍 实时荧光定量 实验设计及应用 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、 TaqMan 3、 Molecular Beacon 4、 Amplisensor 实时荧光定量 PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记 Q Q R 实时荧光定量 PCR 方法 1 SYBR Green 法 SYBR Green 法 SYBR Green 能结合到双链 DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链 DNA结合后才发荧光 变性时， DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链 DNA， SYBR Green 发荧 光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。 SYBR Green 实时荧光定量 PCR原理 SYBR Green I 工作原理 5 3 5 3 SG No Emission SG SG SG Excitation SG SG SG SG SG SG SG 5 3 5 3 Emission Excitation 实时荧光定量 PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 温度 荧光强度 Tm Tm值： DNA解链一半时的温度 实时荧光定量 PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。 (-dI/dT) -dI dT Tm SYBR Green 法 融解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，有杂峰 其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确 非特异性产 物 Cycle number Floures cenc 104 102 Sample Cycle nu mb er Lg of DNA concentration SYBR Green 法 定量原理 模板 DNA量越多，荧光达 到域值的循环数越少。 Lg浓度与循环数呈线性关 系，根据样品 Ct值，就可以计 算出样品中所含的模板量。 SYBR Green 法 -PCR反应的建立 反应体系的建立及优化 : 1. SYBR Green 使用浓度 :太高抑制 Taq酶活性，太低，荧 光信号太弱，不易检测 2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度 :可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物 4. 反应 Buffer 体系的优化 5. 反应温度和时间参数 :由酶和引物决定 6. 其他与常规 PCR相同 SYBR Green 法 应用范围 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化 PCR反应的条件，对 常规 PCR有指导意义，如对 primer的评价；可以 区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产 物。 SYBR Green 法 优缺点 对 DNA模板没有选择性 -适用于任何 DNA 使用方便 -不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链 DNA 结合，产生假阳性 但可以通过 融解曲线的分 析 ，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点 本单位目前开展的工作 多种病原体定量和定性 细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等） 基因表达水平检测 PCR芯片 实时荧光定量 PCR 方法 2 -TaqMan法 与目标序列互补 TaqMan-水解型杂交探针 5 端标记有报告基团 (Reporter, R) ，如 FAM、 VIC等 3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整， R所发射的荧光能量被 Q基团吸收 ，无荧光， R与 Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理， FRET） Taq酶有 53 外切核酸酶活性，可水解探针 TaqMan法 工作原理 每扩增一条 DNA分子，释 放一个荧光信号， 可以在循环过程 中任一点检测荧 光 TaqMan 法 PCR反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针 Tm为 68-70 ， 30 bp, 5不能有 G， G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段 400 bp，引物 Tm为 59-60 2、反应参数的确定： 一般为： 94 ， 10-20S 60 ， 30-60S（ Taq酶 53 外切核酸酶活性在 60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ， 45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小 Ct值，最大信号 /背景比值 引物浓度： 50-900nM 探针浓度： 50-250nM 4、其他与常规 PCR相同 已肝病人血液中 HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒 DNA，扩增病毒基因，以 TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为 106、 105 、 104 、 103 的标准样品各一个，设阴性和空白 对照 实验步骤：提取 HBV DNA 设计特异引物 设计 TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中 HBV DNA的精确 copy数 利用 TaqMan法 检测血液中的 HBV 数据分析 分析结果： HBV DNA的精确 copy数为 3.7X105 利用 TaqMan法 检测血液中的 HBV sample sample TaqMan法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 单核苷酸多态性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP) TaqMan法 优缺点 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 设计相对简单 -与目标序列某一区 域互补 重复性比较好 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 实时荧光定量 PCR 方法 3 - Molecular beacon 法 (分子信标 ) 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 发夹型杂交探针 Molecular beacon (分子信标 ) 工作原理 荧光共振能量转移（ FRET） 探针与 DNA杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光 信号 Molecular beacon (分子信标 ) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP分析 Molecular beacon (分子信标 ) 优缺点 高特异性： 对目标 序列 检测 SNP最灵敏的试 剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特 定目标 设计困难 价格比较高 缺 点 几种方法总结 化学试剂 工作原理 有否淬灭剂 信号检测 主要应用范 围 SYBR Green I 结合于双链 DNA 的小沟中 否 复性 /延伸 熔解曲线分析 定量和检测目标 基因 Molecul ar Beacon 发夹型杂交探针 有 复性 SNP分析 定量和检测目标 基因 TaqMan 水解型杂交探针（ 5-3外切） 有 任何步骤 SNP分析 定量和检测目标 基因 实时荧光定量 PCR的实验设计和数据处理 绝对定量与相对定量 绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板 浓度（ DNA， RNA） 病毒 DNA或 RNA的拷贝数 转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含 量 差异表达分析 芯片评估 转基因生物的检测 基因型检测 实时荧光 PCR绝对定量方法 unknown 104 103 标准品，标准曲线 已知浓度的相应 DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时 PCR反应得到相应的 C(t)，构建标准曲 线 样品 与标准品同时进行 PCR反应得到未知浓度样品的 C(t)值 使用实时荧光定量 PCR进行绝对定量的优势 敏感性高 检测低拷贝数样品：单拷贝 区分小差异样品： 24， 48， 96， 大范围拷贝数样品同时检测 100 1010 省时有效 实时荧光相对定量 相对定量的 目的 比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别 内标基因 内标通常是 b-actin、 GAPDH基因等看家基因 它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒 定，受环境因素影响较小 对目的基因进行均一化：目的基因拷贝每一个 内标基因拷贝 提 纲 实时荧光定量 PCR原理 实时荧光定量 PCR的几种方法介绍 实时荧光定量 PCR实验设计及应用 实时荧光定量 PCR法 标准样品 相对定量中的内标 内标通常是 -actin、 GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素 影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒 DNA和体外转录的 RNA 实时荧光定量 PCR法 标准样品 DNA拷贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的 cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或 cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀 释 实时荧光定量 PCR法 定量方法 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数 ， 通常用到标准 曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因 的表达差异 （ 不同时相 ） 2- C（ t） 双标准曲线法 TaqMan法举例 标记探针 使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量 Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针 TaqMan法举例 材料准备 从正常乳腺组织中提取的 总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总 RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcriptase：基因组对照 TaqMan法举例 反应程序 RT-qPCR 反应程序： 50C,30min 95C,15min 94C,15sec 60C,1min plate read 10C,forever End 35 more times TaqMan法举例 症标记物表达 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 FAM detection for ERBB2 TaqMan法举例 实验结果 定量 Copies ng/ l Total RNA Healthy RNA Tumor RNA Tumor/ Healthy ERBB2 1095 1052 2130 2492 2.16 X GAPDH 95500 85730 136000 130800 1.45 X TaqMan法举例 实验结果 定量分析 ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 Healthy RNA Tumor RNA 0.0115 0.018 0.018/ 0.011 Graph Copies ng/ l Total RNA TaqMan法举例 实验结果 表达差异 Healthy Tissue Carc. Tissue Relative Expression ERBB2的 表达差异 TaqMan法举例 实验结果 讨论 通过 RT-qPCR成功检测了 ERBB2 基因在不同组织的 表达差异；在乳腺 癌组织中， ERBB2的表达量是正常水 平的 1.8倍。