蛋白质组学实验

植物蛋白质组学实验植物蛋白质组学实验范海延范海延 教授教授 Email:123蛋白质组学简介蛋白质组学简介蛋白质组学研究的技术路线蛋白质组学研究的技术路线双向电泳实验双向电泳实验 目目 录录1236.6182284.112964.5641456.7112918.3401760.8272604.2442001.0783131.45601234x10Intens.a.u.100015002000250030003500m/z1416.7171278.7061612.8491094.4921969.071809.364904.5062185.1431674.8521876.9092362.1791156.574985.5152095.0151771.9801742.8590.00.51.01.52.02.53.04x10I nt ens.a.u.100015002000250030003500m/zPROTEOME：PROTEin与与genOME的杂合的杂合 蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它是功能基因组学的是功能基因组学的“中流砥柱中流砥柱”，是联系基因组序列与细胞功能的重要学，是联系基因组序列与细胞功能的重要学科。科。Proteome包括了一个基因组、一种生物或一种细胞包括了一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全组织所表达的全套蛋白质。套蛋白质。一门交叉学科一门交叉学科 物理学物理学 数学数学 化学化学 计算机科学计算机科学 生物信息学生物信息学 基因组基因组 转录组转录组 蛋白组蛋白组蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和质谱技术质谱技术 被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。蛋白质组学的研究技术蛋白质组学的研究技术生物学问题的生物学问题的提出提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对鉴定差异蛋白质鉴定差异蛋白质其它实验的其它实验的进一步验证进一步验证蛋白信息的初步蛋白信息的初步获得获得蛋白质的功能蛋白质的功能蛋白质的表达蛋白质的表达 亚细胞定位亚细胞定位 相互作用相互作用技技术术路路线线 ExPASyExPASy(Expert Protein Analysis System)数据库数据库http:/expasy.org/tools/http:/expasy.org/tools/几乎涵盖了所有蛋白质组学分几乎涵盖了所有蛋白质组学分析工具。如：析工具。如：ProtParamProtParam(http:/expasy.org/tools/protparam.htmlhttp:/expasy.org/tools/protparam.html)软件能检索蛋白质序列理化参数软件能检索蛋白质序列理化参数 PredictProteinPredictProtein（http:/www.predictprotein.org/http:/www.predictprotein.org/）蛋白质序列和结构预测服务网站蛋白质序列和结构预测服务网站 KEGG数据库数据库（http:/www.genome.jp/kegg http:/www.genome.jp/kegg）全球全球影响力最大的代谢数据库之一影响力最大的代谢数据库之一生物信息学生物信息学分析分析细胞破碎细胞破碎蛋白沉淀蛋白沉淀蛋白溶解蛋白溶解去除杂质去除杂质防止蛋白水解防止蛋白水解样品制备样品制备第一向电泳第一向电泳 IEFIEF等电聚焦等电聚焦第二向电泳第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE染色染色定量定量平衡平衡选择胶条选择胶条IPGIPG胶条胶条重泡胀重泡胀电泳电泳选择凝胶选择凝胶灌胶灌胶将将IEFIEF胶条胶条移至第二向移至第二向电泳电泳图像分析图像分析图像采集图像采集斑点检测斑点检测背景消减背景消减凝胶匹配凝胶匹配数据分析数据分析2-DE 实验基本步骤样品制备样品制备TCA/acetoneTCA/acetone法法 取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5mL含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆，放置于-20冰箱过夜。之后4下13000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用含0.2%的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干，放于-80冰箱待用。通常可采用细胞或组织中的通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组全蛋白质组分进行蛋白分进行蛋白质组分析。也可以进行样品质组分析。也可以进行样品预分级预分级，即将细胞或组织，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。P PEG EG 分级沉淀法分级沉淀法：由于：由于PEGPEG分子在溶液中可形成网分子在溶液中可形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用，状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用，使蛋白质分子凝集、沉淀。蛋白质的分子量越大，将使蛋白质分子凝集、沉淀。蛋白质的分子量越大，将蛋白沉淀所需的蛋白沉淀所需的PEGPEG浓度越小；浓度越小；PEGPEG的分子量越高，沉的分子量越高，沉淀蛋白所需的浓度越低。淀蛋白所需的浓度越低。样品制备样品制备聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）分级沉淀法）分级沉淀法 取黄瓜叶片2 g，液氮冷冻研磨，加入10 mL预冷的MgNP-40蛋白质提取液，混匀，4 下13000 g 离心15 min，弃沉淀，上清液加入预冷的50%(w/v)PEG储备液，使PEG终浓度为8%，冰浴30 min，2000 g离心10 min，所得沉淀为F2；上清液继续加入预冷的50%PEG储备液，使PEG终浓度分别为16%，冰浴30 min，13000g离心15 min，所得沉淀为F3；上清液继续加入预冷的50%(wv)PEG储备液，使PEG终浓度为24%，冰浴30 min，13000g离心15 min，所得沉淀为F4；上清液加入4倍体积的TCA/丙酮溶液，4 下20000g离心15 min，得到的沉淀部分为F5，弃上清液。所得的F1、F2、F3、F4、F5分别用TCA丙酮溶液和80%丙酮溶液洗涤至色素完全去除，最后沉淀冻干，放于-80 冰箱待用。消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性。值处的溶解性。兼性离子型去污剂：兼性离子型去污剂：CHAPS，浓度，浓度2-4%；SB3-10、ASB-14 非离子型去污剂：非离子型去污剂：NP-40 和和Triton-X-100 阴离子型去污剂：阴离子型去污剂：SDS，浓度低于，浓度低于0.25%离液剂也称变性剂，主要为尿素（也称变性剂，主要为尿素（urea）和硫尿（）和硫尿（Thiourea），破），破坏蛋白分子间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集及坏蛋白分子间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的形成。蛋白迁移中二级结构的形成。表面活性剂增加样品溶解性的手段 代替盐离子，促进蛋白质溶解，吸附高浓度尿素代替盐离子，促进蛋白质溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子，在溶液中形成的氰酸盐离子，离心时还有助于核离心时还有助于核酸的沉淀。酸的沉淀。IPG buffer3-10 或或 pH5-8和和pH8-10按按2:1混合。混合。还原剂 主要是断裂蛋白质分子中半胱氨酸（主要是断裂蛋白质分子中半胱氨酸（Cys）残基之）残基之间形成的二间形成的二 硫键，增加蛋白质的溶解性。硫键，增加蛋白质的溶解性。-巯基乙醇巯基乙醇 DTT 浓度浓度20-100mmol/L TBP (非巯基还原剂，三丁基膦非巯基还原剂，三丁基膦)，浓度，浓度2mmol/L 载体两性电解质Reagent9.5M Urea,2M Thiourea1%DTT,2mM TBP4%CHAPS0.2%Carrier ampholytes0.25%Tween 2010mM PMSF10%Glycerol0.0002%Bromophenol blueddH2O裂解液蛋白质蛋白质浓度检测浓度检测 Bio-Rad RC DC Protein Assay Bio-Rad RC DC Protein Assay 微离心管检测方法微离心管检测方法 BradfordBradford检测法检测法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250法法 LowryLowry检测法检测法+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 101-D Isoelectric Focusing Theory第一向等电聚焦操作步骤第一向等电聚焦操作步骤1.1.从从-20-20冰箱取出保存的冰箱取出保存的IPGIPG预制胶条（预制胶条（7cm pH3-107cm pH3-10），），室温放置室温放置1010分钟。分钟。2.2.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各在槽两端各1cm1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。3.3.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制用镊子轻轻的去除预制IPGIPG胶条上的保护层。胶条上的保护层。IPG胶条的长度胶条的长度分析型的上样量分析型的上样量（银或（银或SYPRO Ruby染色）染色）制备型的上样量制备型的上样量（考马斯亮蓝染色）（考马斯亮蓝染色）7 cm10-100ug蛋白蛋白200-500ug蛋白蛋白11cm50-200ug蛋白蛋白250-1,000ug蛋白蛋白17cm100-300ug蛋白蛋白1-3mg蛋白蛋白ReadyStripTM IPG胶条的长度胶条的长度上样体积上样体积7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul4.4.分清胶条的正负极，轻轻地将分清胶条的正负极，轻轻地将IPGIPG胶条胶面朝下置于聚胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。5.5.在每根胶条上覆盖在每根胶条上覆盖 2-3m2-3mL L 矿物油，防止胶条水化过程矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。6.6.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。7.7.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳，电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，否则将胶条置于样品水化盘中，-70-70冰箱保存。冰箱保存。7cm 胶条等电聚焦程序 水化 12h（17-20）主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 4000V 线性 3 h 升压 S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持1 1、配好的尿素储液必须马上使用，或用、配好的尿素储液必须马上使用，或用mixed-bedmixed-bed离子离子交换树脂，清除长时间放置时尿素溶液中形成的氰酸盐，交换树脂，清除长时间放置时尿素溶液中形成的氰酸盐，预防蛋白质的甲酰化。预防蛋白质的甲酰化。2 2、将水化上样缓冲液分装后再储存于、将水化上样缓冲液分装后再储存于-20-20。用时，只。用时，只要解冻需要量，其余继续储存。水化上样缓冲液一旦溶要解冻需要量，其余继续储存。水化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻。解不能再冷冻。3 3、将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中、将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中ureaurea的的浓度需浓度需6.5M6.5M。4 4、等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解、等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。质，它能够帮助蛋白质溶解。等电聚焦注意事项等电聚焦注意事项5 5、胶条最少需要经过、胶条最少需要经过1111小时的溶胀。即使看上去所有的小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在的时间。只有在IPGIPG凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。6 6、如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没、如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收，留在胶条的外面，这样就会在胶条的表面形成有被吸收，留在胶条的外面，这样就会在胶条的表面形成并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀，然流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀，然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体。用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体。等电聚焦注意事项等电聚焦注意事项7 7、带上手套用镊子去除、带上手套用镊子去除IPGIPG胶条上的保护层。将胶条上的保护层。将IPGIPG胶条仔细的置于溶胶条仔细的置于溶胀缓冲液上，胶面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。胀缓冲液上，胶面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。8 8、在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖、在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖矿物油之前，可以让胶条先吸收矿物油之前，可以让胶条先吸收1 1小时的液体。小时的液体。IPGIPG胶条上一定要覆盖矿胶条上一定要覆盖矿物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩，导致尿素沉淀。作为防止缓冲物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩，导致尿素沉淀。作为防止缓冲液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全的覆盖住液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全的覆盖住每一根胶条。每一根胶条。9 9、不同的样品需要的、不同的样品需要的volt-hoursvolt-hours不同。当聚焦过程无法达到最高电压不同。当聚焦过程无法达到最高电压时，只要最后能达到总的时，只要最后能达到总的volt-hoursvolt-hours，且，且7cm7cm胶条电压不低于胶条电压不低于30003000伏，伏，11cm11cm胶条电压不低于胶条电压不低于50005000伏，伏，17cm17cm胶条电压不低于胶条电压不低于70007000伏，也能对样品伏，也能对样品进行充分的聚焦。进行充分的聚焦。等电聚焦注意事项等电聚焦注意事项1010、为使样品进入胶的效率增加，采用、为使样品进入胶的效率增加，采用50V50V低电压溶胀；继续以低电低电压溶胀；继续以低电压梯度（压梯度（200V200V，500V500V，1000V1000V各一个小时）进行电泳，最后达到各一个小时）进行电泳，最后达到10000V10000V进行聚焦。进行聚焦。1111、处理预制、处理预制IPGIPG胶条时，一定要始终带着手套。注意预防角蛋白污胶条时，一定要始终带着手套。注意预防角蛋白污染。染。1212、水化上样缓冲液的成分由不同的样品决定。、水化上样缓冲液的成分由不同的样品决定。1313、每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的、每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的pHpH范围，及最范围，及最终的检测方式决定。终的检测方式决定。1414、所有含尿素的溶液加热温度不超过、所有含尿素的溶液加热温度不超过3030，否则会发生蛋白氨甲酰，否则会发生蛋白氨甲酰化，使蛋白质化，使蛋白质pIpI值偏移。值偏移。等电聚焦注意事项等电聚焦注意事项1515、主动水化过程，会帮助大分子量的蛋白质进入胶条，但会丢失部、主动水化过程，会帮助大分子量的蛋白质进入胶条，但会丢失部分小分子量蛋白。分小分子量蛋白。1616、当样品中含盐量较高时，建议选用慢速升压。当样品中含盐量一、当样品中含盐量较高时，建议选用慢速升压。当样品中含盐量一般时，选用线性升压。当样品中含盐量很少时，可以选用快速升压，这般时，选用线性升压。当样品中含盐量很少时，可以选用快速升压，这样可以节省聚焦时间。样可以节省聚焦时间。1717、虽然仪器中每根胶条的极限电流可以设为、虽然仪器中每根胶条的极限电流可以设为9999 A/A/根。但一般根。但一般7cm7cm胶胶条的极限电流不超过条的极限电流不超过3030 A/A/根，根，17cm17cm胶条的极限电流不超过胶条的极限电流不超过5050 A/A/根，最根，最好也在好也在3030 A/A/根以下。根以下。1818、可以在聚焦盘的两端电极处搭上盐桥，这可以帮助除盐。但需注、可以在聚焦盘的两端电极处搭上盐桥，这可以帮助除盐。但需注意的是，盐桥必须是湿润的但水不能太多，必要时需用滤纸吸去多余的意的是，盐桥必须是湿润的但水不能太多，必要时需用滤纸吸去多余的水份。保持盐桥与电极的紧密接触。水份。保持盐桥与电极的紧密接触。1919、程序设置中的除盐步骤，可根据具体情况进行设置，如果样品中、程序设置中的除盐步骤，可根据具体情况进行设置，如果样品中含盐量较高可设置多步除盐，并加长除盐时间。但这种方法只能除去很含盐量较高可设置多步除盐，并加长除盐时间。但这种方法只能除去很少量的盐离子，所以最好是在上样前，对样品进行除盐处理。少量的盐离子，所以最好是在上样前，对样品进行除盐处理。等电聚焦注意事项等电聚焦注意事项+pH 3pH 7.5pH10pH 3pH 7.5pH10chargesize2-D Theory1 1、配制、配制10%10%的丙烯酰胺凝胶两块。配的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml80ml凝胶溶液，每块凝胶溶液，每块凝胶凝胶40ml40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm1cm的的空间，用空间，用MilliQMilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，聚合平整，聚合3030分钟，一般凝胶与上方液体分层后，表明凝分钟，一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。胶已基本聚合。2 2、待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的、待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQMilliQ水、乙醇或水、乙醇或水饱和正丁醇，用水饱和正丁醇，用MilliQMilliQ水冲洗。水冲洗。3 3、从、从-20-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置冰箱中取出的胶条，先于室温放置1010分钟，分钟，使其溶解；使其溶解；4 4、配制胶条平衡缓冲液、配制胶条平衡缓冲液I I。第二向第二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳操作步骤电泳操作步骤5 5、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQMilliQ水浸湿，挤水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。6 6、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入条的槽中加入5ml5ml胶条平衡缓冲液胶条平衡缓冲液I I。将样品水化盘放在水。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃平摇床上缓慢摇晃1515分钟。分钟。7 7、配制胶条平衡缓冲液、配制胶条平衡缓冲液IIII。8 8、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液的胶条平衡缓冲液I I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液胶条平衡缓冲液IIII，继续在水平摇床上缓慢摇晃，继续在水平摇床上缓慢摇晃1515分钟。分钟。9 9、用滤纸吸去、用滤纸吸去SDS-PAGESDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。1010、将琼脂糖封胶液进行加热溶解。、将琼脂糖封胶液进行加热溶解。1111、将、将1010电泳缓冲液，用量筒稀释电泳缓冲液，用量筒稀释1010倍，成倍，成1 1电泳缓电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。冲液。赶去缓冲液表面的气泡。1212、第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的、第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液胶条平衡缓冲液IIII。并用滤纸吸取多余的平衡液。并用滤纸吸取多余的平衡液。1313、将、将IPGIPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在一端使胶面完全浸末在1 1电泳缓冲液中。然后将胶条胶面电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。1414、将放有胶条的、将放有胶条的SDS-PAGESDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。琼脂糖封胶液。1515、用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将、用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。的支撑膜，不要碰到胶面。1616、放置、放置5 5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。1717、在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶、在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。转移至电泳槽中。1818、在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，、在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（起始时用的低电流（5mA/gel/17cm5mA/gel/17cm）或低电压，）或低电压，待样品在完全走出待样品在完全走出IPGIPG胶条，浓缩成一条线后，再胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm20-30mA/gel/17cm），待），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。1919、电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝、电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。2020、进行染色。、进行染色。高灵敏度高灵敏度 宽的定量线性范围宽的定量线性范围 低毒安全低毒安全 对环境无不良影响对环境无不良影响 兼容质谱分析兼容质谱分析 目前的技术没有完全符合上述要求的，从事双向电泳的目前的技术没有完全符合上述要求的，从事双向电泳的实验室需要应用不只一种的检测方法。实验室需要应用不只一种的检测方法。胶上蛋白质的检测考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色 1.1.用去离子水清洗凝胶两次，每次用去离子水清洗凝胶两次，每次10min10min，以去除，以去除SDSSDS。2.2.固定：固定：5050乙醇乙醇/10/10冰醋酸冰醋酸/的水溶液，至少的水溶液，至少30min,30min,可过夜。可过夜。3.3.染色：染色液为染色：染色液为4545甲醇甲醇/10/10冰醋酸冰醋酸/0.25/0.25G-250G-250溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少2h2h。4.4.脱色：多次更换脱色液（脱色：多次更换脱色液（2525乙醇乙醇/8/8冰醋酸溶液）冰醋酸溶液）直至背景脱净。直至背景脱净。5.5.保存：用保险膜包裹，可存一个月。或脱色后在保存：用保险膜包裹，可存一个月。或脱色后在-8080下保存。下保存。Molecular Imager FX Pro Plus MultiImager System Fluorescent and storage phosphor imaging 488 nm,532 nm,and 635 nm laser excitation sourcesGS-800 Calibrated DensitometerReflectance and transmittance modes30 x 40 cm scanning areaVersaDoc Imaging System CCDbased UV/visible,fluorescence,and chemiluminescent imaging凝胶成像与计算机图像分析凝胶成像与计算机图像分析