生物工程下游技术第三章微载体培养技术

第三章第三章 微载体培养技术微载体培养技术（microcarriermicrocarrier culture technique culture technique）一、何谓微载体？一、何谓微载体？指直径指直径60-250m60-250m，能适用于贴壁细胞生长的微珠。，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。但产率低，劳动强度大，占空间大。如何增加细胞生长的贴壁面积？如何增加细胞生长的贴壁面积？微载体系统微载体系统19671967年被用于动物细胞大规模培养。年被用于动物细胞大规模培养。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。微载体培微载体培养系统养系统培养培养4h4h，微载体间的细，微载体间的细胞胞“桥联桥联”200200 电镜下串在一起的电镜下串在一起的肝细胞微载体肝细胞微载体730 730 由于肝细胞的粘附作用微载由于肝细胞的粘附作用微载体形成体形成“串珠串珠”400400 脊髓灰质炎、狂脊髓灰质炎、狂犬和乙脑等疫苗犬和乙脑等疫苗二、微载体的商品类型二、微载体的商品类型第一种微载体第一种微载体：Van WezelVan Wezel用用DEAE-Sephadex A50DEAE-Sephadex A50研制而来研制而来市售（国际）种类有十几种以上：市售（国际）种类有十几种以上：液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMAPHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等等常用商品化微载体有三种：常用商品化微载体有三种：Cytodex1 Cytodex1、2 2、3 3，CytoporeCytopore和和CytolineCytoline显微镜下的高密度微载体显微镜下的高密度微载体l优良的微载体应具有的特性优良的微载体应具有的特性价廉价廉，能，能重复重复使用。使用。不含不含能能毒害毒害细胞细胞的的成分成分；微载体须微载体须与细胞有良好的相容性与细胞有良好的相容性；密度密度应应略大于培养基略大于培养基；粒径粒径在在4040120120m m范围，生理盐水溶胀后增大到范围，生理盐水溶胀后增大到6060250 250 m m，粒度分布地均匀，径差不大于，粒度分布地均匀，径差不大于20202525m m；良好的良好的光学透明性光学透明性；能在能在PBSPBS中中耐耐120120125125、202030min30min高温灭菌高温灭菌；应是应是非刚性材料非刚性材料；不吸收不吸收培养基中的培养基中的营养成分营养成分；收获收获细胞或细胞制品细胞或细胞制品容易容易，不影响蛋白质分离纯化不影响蛋白质分离纯化；三、微载体培养原理与操作三、微载体培养原理与操作 1 1、原理：、原理：将对细胞无害的颗粒将对细胞无害的颗粒微载体加入到培养容器的微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。始终保持悬浮状态。丝网丝网微载体微载体通气的培养基通气的培养基鼓泡器鼓泡器搅拌叶轮搅拌叶轮微载体培养装置图微载体培养装置图微载体的大小微载体的大小：增大单位体积内表面积增大单位体积内表面积（S/FS/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在径尽可能小，最好控制在100-200m100-200m之间。之间。微载体的密度微载体的密度：一般为一般为1.03-1.05g/cm1.03-1.05g/cm2 2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。微载体的表面电荷微载体的表面电荷：据研究，控制细胞据研究，控制细胞贴壁的基本因素贴壁的基本因素是电荷密度是电荷密度而不是电荷性质而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生密度过大，反而会产生“毒性毒性”效应。效应。细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接接触概率和相融性触概率和相融性。细胞细胞增殖阶段：增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层黏附贴壁、生长和扩展成单层贴壁依赖性细胞在微载体表面上：贴壁依赖性细胞在微载体表面上：贴附是进一步铺展和生长的关键，贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静主要是靠静电引力和范德华力电引力和范德华力VeroVero细胞在细胞在Cytodex-3Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化微载体表面粘附铺展的形貌变化通常做法：通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢微载体培养的搅拌非常慢，最大速度，最大速度75r/min75r/min。2 2、搅拌转速：、搅拌转速：动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，。搅拌速率越大，制得的微球越小，搅拌速率越大，制得的微球越小，聚合物浓度越大，制得的微球较大聚合物浓度越大，制得的微球较大以聚己内酯（以聚己内酯（PCLPCL）、聚左旋乳酸（）、聚左旋乳酸（PLLAPLLA）、聚乙醇酸）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（聚乳酸共聚物（PGLAPGLA）为基质制备可生物降解微载体）为基质制备可生物降解微载体 3 3、细胞与微载体的相融性：、细胞与微载体的相融性：与与微载体表面理化性质微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理有关。一般细胞在进入生理pHpH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。荷的细胞也能贴附。(a)MCC(a)MCC细胞，未经处理的细胞，未经处理的Cytodex-3Cytodex-3表面；表面；(b)MCC(b)MCC细胞，用纤粘连蛋细胞，用纤粘连蛋白处理后的白处理后的Cytodex-3Cytodex-3表面表面 (c)Vero(c)Vero细胞，未经处理的细胞，未经处理的Cytodex-3Cytodex-3表面；表面；(d)Vero(d)Vero细胞，用层粘连蛋白处理的细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3Cytodex-3表面表面(e)Vero(e)Vero细胞，细胞，用纤粘连蛋白处理的用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3Cytodex-3表面表面细胞（细胞（VeroVero和和MCCMCC）在不同外源基质处理的（）在不同外源基质处理的（Cytodex-3Cytodex-3）微载体上贴附）微载体上贴附 4 4、细胞在微载体表面的生长细胞在微载体表面的生长 受影响因素：受影响因素：l细胞方面细胞方面：细胞群体、状态和类型。：细胞群体、状态和类型。l微载体方面微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和：微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。则扩展慢。l培养环境中培养环境中：培养基组成、温度、：培养基组成、温度、pHpH、DODO以及代以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。慢。微载体系统培养细胞的步骤微载体系统培养细胞的步骤：(1)(1)选择合适的微载体类型选择合适的微载体类型(2)(2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒(3)(3)接种接种 (4)(4)培养观察与细胞记数培养观察与细胞记数 (5)(5)消化消化(6)(6)分离细胞分离细胞(7)(7)传代培养传代培养交联葡聚糖交联葡聚糖纤维素为基质微载体纤维素为基质微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体:蛋蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合）黄色，表面特性好，易与细胞结合）高分子材料为基质微载体高分子材料为基质微载体无机玻璃基质微载体无机玻璃基质微载体 微载体基质微载体基质PCLPCL微球表面多皱，微球表面多皱，PLLAPLLA微球表面布满坑洞，微球表面布满坑洞，PGLAPGLA微球表面光滑微球表面光滑不同种类聚酯的微球表面形貌差异不同种类聚酯的微球表面形貌差异多孔载体培养多孔载体培养优点优点:降低血清用量，增加细胞固定性降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大，。生长空间大，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养。胞的固定化连续灌流培养。多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。简单，特别适合于反应器大规模培养。多孔载体制备的材料选择多孔载体制备的材料选择(1(1)生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用。细胞有良好的黏附作用。(2)(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。回收利用的要求。(3)(3)热稳定性：在热稳定性：在121 121 、蒸汽灭菌下不分解、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。不破碎、不软化。主要考虑生物相容性、机械稳定性和热稳定性主要考虑生物相容性、机械稳定性和热稳定性5 5、微载体培养操作要点、微载体培养操作要点 培养初期培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的保证培养基与微球体处于稳定的pHpH与温度水平与温度水平，接，接种细胞（对数生长期）至终体积种细胞（对数生长期）至终体积1/31/3的培养液中，的培养液中，以以增加细胞与微载体接触的机会增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度不同，常使用用浓度及接种细胞密度不同，常使用2-3g/L2-3g/L的微载的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。液。l贴壁阶段（贴壁阶段（3-8d3-8d）后）后，缓慢加入培养液至工作体积，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度并且增加搅拌速度保证完全均质混合保证完全均质混合。培养维持期培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率增加搅拌速率。经过经过3d3d左右，培养液开始呈酸性，需左右，培养液开始呈酸性，需换液换液（停止搅拌，让微珠沉淀停止搅拌，让微珠沉淀5min5min，弃掉适宜，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（3737），重新开始搅拌。），重新开始搅拌。收获细胞收获细胞：首先首先排干排干培养液，至少用缓培养液，至少用缓冲液冲液漂洗漂洗1 1遍，然后遍，然后加入加入相应的相应的酶酶，快速，快速搅拌搅拌（75-125r/min75-125r/min）20-30min20-30min。然后。然后解解离收集离收集细胞及其产品细胞及其产品。微载体培养的放大微载体培养的放大：可以通过：可以通过增加微载体的含增加微载体的含量或培养体积量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L4000L以上。以上。细胞形态饱满、细胞形态饱满、生长良好生长良好细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量微载体上细胞几乎长满明显增加，少量微载体上细胞几乎长满微载体上细胞基本长微载体上细胞基本长满，细胞形态健康满，细胞形态健康微载体上细胞更加致密，细胞微载体上细胞更加致密，细胞密度达到密度达到5106个个/ml以上以上微载体上细胞依然良好，微载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象没有明显细胞脱落现象Marc145细胞微载体培养第细胞微载体培养第1天天Marc145细胞微载体培养第细胞微载体培养第2天天Marc145细胞微载体培养第细胞微载体培养第3天天Marc145细胞微载体培养第细胞微载体培养第4天天Marc145细胞微载体培养第细胞微载体培养第10天天四、四、微载体培养优点微载体培养优点 培养系统占地面积和空间小。培养系统占地面积和空间小。表面积表面积/体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；培养基利用率较高；放大容易；放大容易；细胞收获过程不复杂；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；劳动强度小；传统方法传统方法疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。Baxter Biomedical研究中心，研究中心，奥地利奥地利如今如今大规模微载体培养大规模微载体培养VeroVero细胞生产流感疫苗成为可能细胞生产流感疫苗成为可能驯化驯化VeroVero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养基内生长。中试生产中最终的生物反应器规模是基内生长。中试生产中最终的生物反应器规模是12001200升。升。包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大到生产体积为到生产体积为60006000升。升。关于关于H1N1H1N1疫苗生产疫苗生产流感疫苗生产的大规模生产区域流感疫苗生产的大规模生产区域(A)(A)细胞培养细胞培养 (B)(B)离心分离离心分离(C)(C)超滤、洗滤。超滤、洗滤。VeroVero细胞流感疫苗生产图细胞流感疫苗生产图 (A)(A)未感染的细胞未感染的细胞 (B)(B)早期细胞病变早期细胞病变影响影响 (C)(C)收获前的晚期细胞病变收获前的晚期细胞病变大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片