大肠杆菌表达系统详细表格课件

1大肠肠杆菌表达达系统统魔天记21.大肠肠杆菌表达达体系的组组成 一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体表达载体和和宿主菌宿主菌两部分构成。为了改善表两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。发展了许多表达载体和相应的宿主菌。表达过程：表达过程：包含启动启动子、目的基因编码编码序列和转录终转录终止序列的载载体进进入受体细细胞后，可以利用受体细细胞的复复制、转录转录和翻译译体系表达产达产生目的蛋白。31.1 1.1 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体 1.1.1 组组成部分 1.1.启动子：启动子：最佳启动子具备的条件最佳启动子具备的条件 第一第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的达量占细胞总蛋白的10%-30%10%-30%以上以上 第二第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件的条件 第三第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。廉价的诱导物而得以诱导。42.2.转录终止子转录终止子 启动子封堵作用启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。转录终止子还能增强转录终止子还能增强mRNAmRNA分子的稳定性，从而提分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。高蛋白质产物的水平。3.3.核糖体结合位点核糖体结合位点 能被核糖体识别的位点，转录成能被核糖体识别的位点，转录成mRNAmRNA分子后，核糖体分子后，核糖体在这一位点上结合。在这一位点上结合。5 4.4.转译起始序列转译起始序列 5-5-末端结构特征，决定末端结构特征，决定mRNAmRNA的转译起始效的转译起始效率。率。5.5.转译增强子转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。率。6.6.转译终止子转译终止子 mRNAmRNA转译终止必须存在终止密码子。转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌格外偏爱使用终止子大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAAUAA，尤其是在，尤其是在其后加上其后加上U U形成形成UAAUUAAU四联核苷酸的情况下，转四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。译终止的效率便会得到进一步的增强。6启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点转录终止子转录终止子复制起点复制起点7常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体 1.Lac1.Lac启动子的表达载体启动子的表达载体 2.Trp2.Trp启动子的表达载体启动子的表达载体 3.P3.PL L启动子的表达载体启动子的表达载体8 laclac启动子：控制编码启动子：控制编码-乳糖苷酶的乳糖苷酶的lacZlacZ基因基因转录的序列，可以被转录的序列，可以被IPTGIPTG所诱导，所以加入诱导物所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。理论上，凡是具有包括控制区段在内的理论上，凡是具有包括控制区段在内的laclac操操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的体的条件。这类表达载体的最突出的特点特点是，含有是，含有一条足够大的编码一条足够大的编码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的lacZlacZ基因片断。基因片断。因此，每当有一个克隆的外源因此，每当有一个克隆的外源DNADNA片断插入到这个片断插入到这个启动子之后启动子之后,仍保持着仍保持着lacZlacZ基因固有的读码结构时，基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质半乳糖苷酶组成的融合蛋白质.LacLac启动子的表达载体启动子的表达载体910质粒的构建：质粒的构建：将含有将含有laclac启动子的启动子的HaeHaeIII III 酶切片断，经平末酶切片断，经平末端连接，克隆到经端连接，克隆到经EcoR1EcoR1切割并对其粘性末端进行填切割并对其粘性末端进行填补修复的补修复的pBR322pBR322质粒上。质粒上。1112TrpTrp启动子的表达载体启动子的表达载体 色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被被3-3-吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是，它吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于所合成的蛋白质产量高于laclac启动子表达载体系统，并启动子表达载体系统，并且是诱导型的。且是诱导型的。构建：构建：1.1.大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的的5.4kb Hind5.4kb HindIII III 片断，片断，含含有有trptrp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpEtrpE基基因、因、trpDtrpD基因的部分序列。基因的部分序列。2.2.将此片断，克隆到将此片断，克隆到pBR322pBR322质粒的质粒的HindHindIII III 位点，位点，构建成了构建成了ptrpED3ptrpED3表达载体（含有两个表达载体（含有两个HindHindIII III 位点）。位点）。3.3.HindHindIIIIII部分酶切消化，将靠近部分酶切消化，将靠近EcoR1EcoR1位点的一个位点的一个HindHindIII III 位点，经核酸外切酶和位点，经核酸外切酶和S1S1核酸酶处理，消除掉核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体构建新的质粒载体ptrpED5-1.ptrpED5-1.1314P PL L启动子的表达载体启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一动子之一.PL.PL启动子：是负责启动子：是负责 DNA DNA分子分子转录的启动子之一。转录的启动子之一。PLPL启动子是可以被启动子是可以被 E.coli RNAE.coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体转录噬菌体DNADNA。该启动子可以被。该启动子可以被cIcI基因产基因产物所抑制。携带物所抑制。携带PLPL启动子的载体使用温度启动子的载体使用温度敏感的敏感的E.coli cIE.coli cI突变体。在较低的温度下，突变体。在较低的温度下，突变体所产生的突变体所产生的cIcI蛋白可以抑制蛋白可以抑制 PLPL启动子，启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。因的转录。15 pPLc24 pPLc24表达载体：表达载体：用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。这个质粒表达载体含有这个质粒表达载体含有MS2-MS2-聚合酶基因开始的聚合酶基因开始的9898个密个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。达。在在MS2-MS2-聚合酶基因下游，存在聚合酶基因下游，存在BamHBamHI I和和HindIIIHindIII 单切点。单切点。EcoRIEcoRI单切点靠近单切点靠近 P PL L启动子，处于转译起启动子，处于转译起始密码子之前。始密码子之前。1617 T7T7表达系统表达系统 大肠杆菌大肠杆菌T7T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为称为T7T7表达系统。表达系统。T7T7噬箘体基因噬箘体基因1 1编码的编码的T7 RNAT7 RNA聚合聚合酶选择性的激活酶选择性的激活T7T7噬箘体启动子的转录。它是一种高噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的活性的RNARNA聚合酶，合成聚合酶，合成mRNAmRNA的速度比大肠杆菌的速度比大肠杆菌RNARNA聚聚合酶快合酶快5 5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNARNA聚合聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNAT7 RNA聚合酶和聚合酶和T7T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过录竞争不过T7T7噬箘体转录体系。最终受噬箘体转录体系。最终受T7T7噬箘体启动噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。子控制的基因的转录能达到很高的水平。18 Cassettes Cassettes和基因融合和基因融合 一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E.coliE.coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个信号组成一个cassettecassette。某些某些cassettecassette载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结合位点临近，而是在一段合位点临近，而是在一段E.coliE.coli基因之后，基因之后，E.coliE.coli的基因直的基因直接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框架的方式进行，这样就产生了架的方式进行，这样就产生了杂交的基因杂交的基因。因此基因的表达产。因此基因的表达产物是一个蛋白质的杂交分子，包含物是一个蛋白质的杂交分子，包含E.coliE.coli阅读框架编码的短肽阅读框架编码的短肽和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有四个优点四个优点：1)1)克隆基因的克隆基因的mRNAmRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如果相关的序列是由果相关的序列是由E.coliE.coli序列组成，可以避免这一可能性。序列组成，可以避免这一可能性。2)2)在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞降解。降解。3)3)细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。如如ompAompA或者或者malEmalE基因，这样重组蛋白可以被输出到细胞外，进基因，这样重组蛋白可以被输出到细胞外，进入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。4)4)细菌片段可以通过亲合色谱法辅助重组蛋白的提取。例细菌片段可以通过亲合色谱法辅助重组蛋白的提取。例如与如与E.coli E.coli 谷胱甘肽谷胱甘肽-S-S-转移酶融合的蛋白可以吸附到含有结转移酶融合的蛋白可以吸附到含有结合谷胱甘肽的琼脂糖柱上合谷胱甘肽的琼脂糖柱上。192.外源基因在大肠杆菌细胞中的表达外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 融合蛋白质的表达融合蛋白质的表达 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性202.1 2.1 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 1.1.细胞质中表达细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分21优点：优点：a.a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b.b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c.c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害 d.d.蛋白质的产量高蛋白质的产量高 (二硫键的断裂二硫键的断裂以及转译修饰作以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。中超量表达。)缺点：缺点：a.a.折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b.b.蛋白质的终产量偏低蛋白质的终产量偏低 c.c.蛋白质的生产成本比较昂贵蛋白质的生产成本比较昂贵 d.d.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂蛋白质种类多，因此纯化比较复杂222.2.周质中表达：周质中表达：周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。膜和外膜之间的细胞结构部分。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。胞质中穿过细胞质内膜进入周质。优点：优点：a.a.目标蛋白质的纯化比较简单目标蛋白质的纯化比较简单 b.b.蛋白质酶解的程度不甚严重蛋白质酶解的程度不甚严重 c.c.促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）环境）缺点：缺点：a.a.信号肽并非总是有助于蛋白质的转运信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 b.b.有可能形成包涵体有可能形成包涵体 233.3.胞外表达：胞外表达：使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。泌到胞外培养基中进行分离纯化。途径：途径：1.1.用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）的程序）2.2.诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）中等产量的蛋白质）24优点：优点：1.1.蛋白质的酶解作用程度低蛋白质的酶解作用程度低 2.2.由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化白容易纯化 3.3.增进了蛋白质的折叠作用增进了蛋白质的折叠作用 4.4.蛋白质蛋白质N-N-末端的结构真实末端的结构真实缺点：缺点：1.1.在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的常是不会分泌到胞外培养基中去的 2.2.由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂此目标蛋白质的纯化过程比较复杂25 3.3.宿主细胞宿主细胞 在大肠杆菌细胞内表达目的基因的在大肠杆菌细胞内表达目的基因的主要主要优势优势:一个一个是宿主的遗传背景比较清楚是宿主的遗传背景比较清楚,易于易于控制基因的表达控制基因的表达;另一个另一个是大肠杆菌容易培养是大肠杆菌容易培养,可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业应用中很多的蛋白产物是真核基因编码应用中很多的蛋白产物是真核基因编码,并且并且具有高级的三、四级结构具有高级的三、四级结构,要求翻译后加工为要求翻译后加工为正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核细胞具有很大的差异细胞具有很大的差异,所以在应用大肠杆菌系所以在应用大肠杆菌系统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进化的方法改造细胞化的方法改造细胞,解决大肠杆菌表达系统的解决大肠杆菌表达系统的局限性局限性,提高产物的活性。提高产物的活性。26 近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。重组蛋白质修饰加工研究等内容。4.4.大肠杆菌表达系统研究的新大肠杆菌表达系统研究的新进展进展27大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物28大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素291.1.5-UTR5-UTR对克隆基因表达效率的影响对克隆基因表达效率的影响 a a.启动子结构对表达效率的影响启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的保守序大肠杆菌启动子的保守序3535区（区（5TTGACA5TTGACA）和和10(5TATAAT)10(5TATAAT)区区;它们之间的距离它们之间的距离(17bp)(17bp)。b b.启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响影响 当当mRNAmRNA分子分子55末端与末端与SDSD序列之间的长度小于序列之间的长度小于1 15bp5bp时，转译效率下降。时，转译效率下降。影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素30、2.2.质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响响 a.a.质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b.b.质粒载体的不稳定性对表达效率的影响质粒载体的不稳定性对表达效率的影响313.mRNA3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影转录本的分子特性对基因表达效率的影响响 a.a.转译起始序列对表达效率的影响转译起始序列对表达效率的影响 SDSD序列后面的序列后面的4 4个碱基，个碱基，T T或或A A时转译作时转译作用较高，用较高，C C或或G G时，下降时，下降50%50%或或25%25%；位于起始密码子位于起始密码子AUGAUG上游的密码三联体上游的密码三联体的碱基，的碱基，CUUCUU或或UAUUAU时转译效率最有效，时转译效率最有效，UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG时下降时下降2020倍；倍；位于起始密码子位于起始密码子AUGAUG下游的密码子碱基下游的密码子碱基组成，也影响转译的速率。组成，也影响转译的速率。b.mRNAb.mRNA的稳定性对表达效率的影响的稳定性对表达效率的影响324.4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a.a.密码子使用的偏爱性现象的规律性密码子使用的偏爱性现象的规律性 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子；或两个是优先使用的偏爱性密码子；一些密码子在各种不同基因中都是最常用的一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸（在编码脯氨酸4 4种同义密码子，种同义密码子，CCCCCC是优先是优先使用的）使用的）高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNtRNA A丰度。丰度。33b.b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。的表达。不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。345.5.寄主细胞的生理状态对基因表达效率寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养培养基营养成分的选择、细胞培养方式、培养温度等环境因素能影响大肠方式、培养温度等环境因素能影响大肠杆菌生理状态。杆菌生理状态。35