反相高效液相色谱法分析甲苯和联苯

反相高效液相色谱法分析甲苯和联苯一、目的要求1 理解反相高效液相色谱法的基本原理及影响组分保留值的因素。2 学习用反相高效液相色谱法分析混合芳烃。3. 掌握HPLC分析的定性、定量方法。4 理解流动相组成对样品组分保留时间的影响。二、方法原理用非极性的十八烷基键合固定相，多以甲醇-水或乙睛-水作为流动相(极性 流动相)，用以分离非极性或极性小的化合物，该方法是目前最常用的反相液相 色谱法。化学键合固定相是在薄壳型或全多孔硅胶微粒上，通过化学反应把有机分子 键合到无机担体表面。其优点是固定相表面更加均匀一致，能灵活的改变吸附剂 表面性质，提高选择性，增强稳定性，延长柱的寿命。反相键合相的保留机制是 疏水效应起主导作用，所以样品组分的疏水性差异是分离的基础。对非离子型化 合物，分子极性愈大，保留值愈小；对非极性化合物，分析表面积愈大，保留值 愈大；在同系物中链愈长、苯环愈多，保留值愈大。流动相也影响被测组分的保 留值，流动相的表面张力愈小，保留值愈小。在常用的溶剂中，以水的表面张力 最大，因此流动相中水的含量减小，流动相的表面张力下降，组分的保留值减小。本实验分离甲苯、联苯2 种芳烃的混合物，由于苯环个数或分子的表面积有 显著差别，因此在反相高效液相色谱中得到很好的分离。用保留时间定性，根据 峰面积标准工作曲线定量。三、仪器与试剂1. 仪器：Shimadzu LC-10ATVP高效液相色谱仪，检测器为SPD-MlOAvp二极 管阵列检测器。10uL HPLC 微量进样注射器。超声波清洗器及玻璃器皿。2. 试剂：甲苯、联苯、甲醇等试剂均为A.R.级。二次蒸馏水。标准混合储备液： 1.00mg/mL 甲苯、联苯的甲醇溶液。3. 色谱条件：色谱柱：Shimadzu VO-ODS (4.6x150mm) C18 分析柱流动相：A液：水；B液：甲醇。用前用超声波脱气。UV-检测器，检测波长254nm。进样体积：10uL;流动相流速：1.0mL/min。样品：甲苯、联苯的混合甲醇溶液。四、试验步骤1. 开启色谱仪，先开启泵、在线脱气机、柱温箱、检测器，再开启系统控制器， 最后开启电脑。2. 双击CLASS-VP软件，双击PDA检测器，打开文件，设立新方法，设置流 动相A液和B液的比例为1： 9,流动相流量为1.0mL/min,柱温为40C，检测波 长为254n m,使其正常运行。3标准溶液的配制：分别移取0.1mL,0.3 mL, 0.5mL标准溶液储备液于10 mL容 量瓶中，用甲醇定容。各溶液的浓度分别为： 0.010mg/mL, 0.030 mg/mL, 0.0500 mg/mL。4. 标准工作曲线的绘制：分别注入不同浓度的标准溶液10.0uL,记录色谱图。以 峰面积对各组分的进样量绘制标准工作曲线。5. 试样的测定：注入样品溶液lO.OuL,记录色谱图，由工作曲线计算未知样品中 甲苯和联苯的含量。6. 改变流动相的配比(1： 9； 0： 10)，观察色谱峰保留时间的变化。7. 改变柱温(40C, 30C)，观察色谱峰保留时间的变化。8. 实验结束时，用甲醇冲洗色谱仪液路系统和注射器，然后按照与开机相反的 顺序关机。五、结果处理1. 以峰面积对各组分的含量绘制标准工作曲线。2. 根据保留时间进行定性；对试样各组分依据峰面积由标准工作曲线求得各组分 的含量。3. 计算不同流动相配比和柱温条件下，两峰的分离度。六、注意事项1. 正确使用微量进样注射器，并保持其洁净。抽取试样时，注射器内部不得存留 气泡，针头残存液体要用滤纸吸干。2. 吸取不同试液时，先用甲醇冲洗干净，再用要抽取的试液抽洗3 次后，方能抽 取进样。使用完毕，须用甲醇抽洗干净后存放。七、思考题1. 解释色谱图上观察到各组分的出峰次序。2. 解释在不同的色谱条件下，色谱图上观察到的谱峰保留时间和分离度的变化。3. 若相邻组分没有达到完全分离，你将采取什么措施使其完全分离？为什么？