利用基因芯片进行基因表达谱分析.PPT

1利用基因芯片进行利用基因芯片进行基因表达谱分析基因表达谱分析第三讲第三讲2 RNA的检测的检测:表达丰度，剪切体表达丰度，剪切体 DNA的检测：的检测：SNP，CGH，Methylation cDNA 芯片的主要用于：表达谱芯片，芯片的主要用于：表达谱芯片，CGH 寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯分型芯片片基因芯片应用基因芯片应用3More Microarray Applications Chromosomes DNA Gene promoters mRNA mRNA variants microRNAs aCGHSNPsmiRNADNARNASNPsChIP/LAmiRNAGeneExpressionAlternateSplicing4双色荧光系统双色荧光系统 cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片 实验组及对照组两种组织的实验组及对照组两种组织的mRNA在反转录成在反转录成cDNA的过程中分别标记上的过程中分别标记上Cy3和和Cy5两种荧光，两种荧光，制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交杂交 两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量，计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量，通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中基因表达是否有变化。基因表达是否有变化。5双荧光系统芯片的原理及流程图双荧光系统芯片的原理及流程图6单色荧光系统单色荧光系统 较短的寡核苷酸芯片如较短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片；芯片；载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用，载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用，如如Illumina芯片芯片 实验组和对照组分别用同样的荧光物质标实验组和对照组分别用同样的荧光物质标记（或生物素记（或生物素biotin），分别与芯片杂交，），分别与芯片杂交，即一张芯片只杂交一个样本即一张芯片只杂交一个样本 根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个片段结合，通过与对照组的比较转化成基片段结合，通过与对照组的比较转化成基因表达的改变因表达的改变7单荧光系统芯片的原理及流程图单荧光系统芯片的原理及流程图8单通道和双通道的比较 单通道实验结果重复性更好，使得比较不单通道实验结果重复性更好，使得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可同样品之间各种基因表达的相对比例是可靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的比较时，只需在多个样本中设置对照。由比较时，只需在多个样本中设置对照。由于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。双通道（点样双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但）重复性相对较差，但是探针可以测序验证。双色法需在每次杂是探针可以测序验证。双色法需在每次杂交检测中设置对照，只能进行两个样品之交检测中设置对照，只能进行两个样品之间的比较，芯片之间的比较并不可靠间的比较，芯片之间的比较并不可靠9Expression Analysis Arrays（Affymetrix)10Unique PM-MM Probe Design11-20 pairs of pairs of 25mer probeAAAAA3UTREach gene is represented on the probe array by multiple probe pairsEach probe pair consists of a perfect match and a mismatch oligonucleotide Perfect MatchMismatchChipProbe PairProbe cell or feature1112PM-MM探针设计的优势探针设计的优势 灵敏度的提高灵敏度的提高 将已克隆的转录产物将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组以不同的浓度掺入到组织样品中。经过标记的织样品中。经过标记的样品与样品与Affymetrix Genechip人类基因组人类基因组芯片杂交，在克隆转录芯片杂交，在克隆转录产物浓度低于产物浓度低于8pM时，时，PM单独探针无法探测单独探针无法探测出相应的浓度变化，而出相应的浓度变化，而与与MM探针联合使用则探针联合使用则可以探测出。可以探测出。13单链和双链探针单链和双链探针 双链探针在液相条件下自我复性从双链探针在液相条件下自我复性从而大大降低与固着的靶而大大降低与固着的靶DNA杂交杂交的机会，从而降低了探测灵敏度，的机会，从而降低了探测灵敏度，因此需更多的探针量。因此需更多的探针量。单链，使杂交灵敏度提高单链，使杂交灵敏度提高14基因芯片实验流程及方法基因芯片实验流程及方法15cDNA microarrayTWO CHANNEL MICROARRAY161718Affymetrix Expression Analysis 19Reverse Transcriptasein vitro transcriptionmRNAcDNAFragmentation of cRNA cRNAGeneChip Hybridization标记标记20 实验过程实验过程 样本制备样本制备 样本标记样本标记 预杂交预杂交 杂交杂交 洗涤洗涤 染色（如生物素染色（如生物素标记）标记）扫描扫描 数据分析数据分析 21Hybridization process of GeneChip Labeling cRNA fragmentHybridization mixtureEukaryoticHyb.ControlControlOligo B2 hybridization（16hour）Data Data analysisanalysisScanScanWash&Wash&stainstain22样本制备样本制备 表达谱基因芯片研究的对象是样本中的表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA，抽提出的，抽提出的mRNA需要经过反转录需要经过反转录酶的作用转变为酶的作用转变为cDNA，同时进行荧光标记，同时进行荧光标记，标记好的标记好的cDNA靶分子就可用于杂交。靶分子就可用于杂交。基因芯片实验中的基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子抽提大都采用分子生物学中传统的方法，但要求必须能够尽生物学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的抽提出组织中的可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持分子，保持实验数据信息与组织中实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息拷贝数信息之间的平行性。之间的平行性。23mRNA的纯化方法的纯化方法 两步法：从样本中制备总两步法：从样本中制备总RNA，再从总，再从总RNA中分中分离离mRNA,总总RNA中包括中包括rRNA、tRNA和和mRNA，其中以上是其中以上是rRNA和和tRNA，分离，分离mRNA的的原理一般利用真核生物的原理一般利用真核生物的mRNA的的端都有端都有polyA尾，用尾，用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化纤维素亲和层析纯化mRNA。一步法：从组织样本中直接用一步法：从组织样本中直接用poly（dT）-纤维纤维素亲和层析纯化素亲和层析纯化mRNA，这种方法简便，但，这种方法简便，但RNA的纯度不够，当组织量少或对的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要求不高质量要求不高时可采用时可采用24逆转录：合成逆转录：合成cDNA一链一链 mRNA逆转录合成逆转录合成cDNA时用时用poly（dT）作）作引物，可以直接用总引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转作为摸板进行逆转录标记，简化步骤，减少录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从的损失，从而减少对组织的需求，也避免了从总而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中中纯化纯化mRNA的工作的工作 总总RNA的纯度不如的纯度不如mRNA高，直接从总高，直接从总RNA进行进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到的逆转录在一定程度上会影响到逆转录标记的效率，需要尽可能保证总逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA的纯度的纯度25样本量样本量 从多少总从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验中进行逆转录才能满足实验需要？非扩增：需要？非扩增：20微克；扩增：微克；扩增：1微克微克 有些情况下，样本极为稀有，不可能得到有些情况下，样本极为稀有，不可能得到大量的大量的mRNA靶分子靶分子 基因芯片实验对总基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程量的需求在一定程度上限制了该技术的推广度上限制了该技术的推广 发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯片实验样本用量片实验样本用量26272829核苷酸的修饰方法核苷酸的修饰方法 荧光标记：需避光，合成效率低，不同的荧光修荧光标记：需避光，合成效率低，不同的荧光修饰会影响标记效率，如饰会影响标记效率，如Cy3标记的和标记的和Cy5标记的标记的NTP掺入到掺入到DNA和和RNA链中的效率是不一样的；链中的效率是不一样的；最终也导致成本高最终也导致成本高 荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光源激发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行源激发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行检测。如花青素（检测。如花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激发，其激发和发射波长分别为：和发射波长分别为：550/570和和649/670。大部分。大部分扫描仪都能对这两种荧光标记进行图像处理。这扫描仪都能对这两种荧光标记进行图像处理。这种标记方法没有同位素标记的限制；而且具有极种标记方法没有同位素标记的限制；而且具有极高的灵敏度，能够进行定量检测高的灵敏度，能够进行定量检测30 生物素标记的生物素标记的dNTP：利用利用biotin-Streptavidin phycoerythrin Fluorescent dye的结合进行检测，的结合进行检测，标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便，扫描成本较低。单方便，扫描成本较低。荧光素标记的荧光素标记的dNTP：Cy3-的的dNTP，Cy5-的的dNTP 同位素标记的同位素标记的dNTP amino allyl（氨烯丙基）（氨烯丙基）NTP：便宜，掺入：便宜，掺入DNA和和RNA链的效率与未标记的链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只相同；检测的时候只需在它的氨基反应基团上偶联需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他系列的染料或其他染料；但实验误差大染料；但实验误差大核苷酸的修饰方法核苷酸的修饰方法31标记方法标记方法 RNA样本不扩增进行标记：在反转录的体样本不扩增进行标记：在反转录的体系中加入系中加入Cy3或或Cy5标记过的标记过的dNTP类似物，类似物，通过反转录酶的作用，标记新合成的通过反转录酶的作用，标记新合成的cDNA。这种实验方法效率较低，对这种实验方法效率较低，对RNA样本需求样本需求量大，通常要量大，通常要50200g总总RNA，13g mRNA RNA样本扩增后进行标记样本扩增后进行标记32 联合应用联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应扩增和模板指导下的体外转录反应来完成线性扩增。来完成线性扩增。PCR方法：方法：同一用量和限制循环次数的条件下，通过同一用量和限制循环次数的条件下，通过RT-PCR可平行的扩增实验组和对照组的可平行的扩增实验组和对照组的RNA样本以满足样本以满足实验要求并同时进行荧光标记。实验要求并同时进行荧光标记。扩增扩增mRNA（cRNA）靶分子）靶分子33 基于基于T7的的mRNA线性扩增：利用模板指导线性扩增：利用模板指导下的体外转录反应来完成线性扩增。该方下的体外转录反应来完成线性扩增。该方法能从法能从150ng mRNA分子出发扩增出足分子出发扩增出足够数量的够数量的cDNA靶分子。这种扩增方法更具靶分子。这种扩增方法更具线性线性扩增扩增mRNA（cRNA）靶分子）靶分子34合成合成cDNA二链二链 在小鼠白血病病毒（在小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶的作用下，）反转录酶的作用下，反转录生产反转录生产cDNA一链。一链。MMLV反转录酶会在反转录酶会在cDNA一链的一链的3端加上非模板的寡聚端加上非模板的寡聚C残基，这时残基，这时加入加入3端带有寡聚端带有寡聚G的引物，可以结合到的引物，可以结合到cDNA的的3端，生成一小段双链的端，生成一小段双链的cDNA，再在，再在DNA聚合聚合酶的作用下延伸形成酶的作用下延伸形成 加入加入RNase H，水解掉，水解掉RNA模板，以残留的与模板，以残留的与cDNA一链配对的短片段一链配对的短片段RNA为引物，在为引物，在DNA聚聚合酶的作用下生成双链合酶的作用下生成双链cDNA3536mRNA cRNA噬菌体噬菌体T7 DNA编码的酶，编码的酶，对对T7启动子序列具有高启动子序列具有高度特异性，不能识别其度特异性，不能识别其它生物来源的启动子。它生物来源的启动子。是依赖于是依赖于DNA的的RNA聚聚合酶，具有合酶，具有53的的RNA聚合酶活性，以含有聚合酶活性，以含有T7启动子序列的双链启动子序列的双链DNA为模板，以为模板，以NTP为底物，为底物，合成与启动子下游的模合成与启动子下游的模板板DNA互补的互补的RNA。373839Fragmentation of biotinylated cRNA40芯片杂交芯片杂交 将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交1小时左右（小时左右（cDNA和长链寡核苷酸，和长链寡核苷酸，42度（度（50甲酰胺）；短链寡核苷酸，甲酰胺）；短链寡核苷酸，50度）度）杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内反应反应14-18小时小时 洗片，扫描检测洗片，扫描检测 杂交量依赖靶杂交量依赖靶DNA和探针的浓度，当靶和探针的浓度，当靶DNA浓浓度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量成线性关系成线性关系41ArrayFragmented cRNA TargetRNA:DNA Hybridized ArrayStreptavidin phycoerythrinFluorescent dyeRNA相对不稳定相对不稳定42杂交过程杂交过程影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素 1核酸浓度核酸浓度 2探针的类型和长度探针的类型和长度3碱基组成碱基组成 4杂交液成分杂交液成分（1）离子强度）离子强度（2）Formamide（3）季铵盐溶液）季铵盐溶液（4）杂交加速剂）杂交加速剂 5不匹配序列不匹配序列6杂交时间杂交时间 7杂交温度杂交温度43原核生物样品44数据分析流程图45Experiment group/control:Hepacellular carcinoma/Normal liver Red:明显上调明显上调Yellow:差异不显著差异不显著Green:明显下调明显下调46 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 假阳性：验证假阳性：验证 基因芯片结果需要传统方法的验证基因芯片结果需要传统方法的验证47新一代芯片技术 光纤微珠芯片n Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,Nature Biotechnology,18,91-94,2000.n Techview:Molecular Biology.Bead-Based Fiber-Optic Arrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,2000n Decoding Randomly Ordered DNA Arrays,Kevin L.Gunderson,Genome Research,14:870-877,2004.48微珠微珠n3.1 um无孔无荧光无孔无荧光硅珠硅珠n每个微珠单独质控每个微珠单独质控有效的反应表面积和体积比有效的反应表面积和体积比低低/无背景无背景大小均一大小均一49Oligator 合成工厂寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针96 孔板全自动化合成孔板全自动化合成LIMS 控制所有过程控制所有过程年生产能力年生产能力 20 million 严格的严格的 QC 系统系统OD260 检测产量检测产量MALDI-TOF 质谱检测质谱检测UV 毛细管电泳毛细管电泳实时数码色彩监控实时数码色彩监控50寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针3 End5 End50 mer 探针探针合成探针从合成探针从3到到5端，保证地址端，保证地址序列能合成并结序列能合成并结合到微珠上。活合到微珠上。活化的微珠的氨基化的微珠的氨基是否只与是否只与oligo的的5端结合？端结合？23 mer 地址序列地址序列73mer5123mer50mer 探针探针3 End5 End探针与微珠连接探针与微珠连接寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针每个微珠上连接每个微珠上连接100万左右万左右相同相同的探针的探针52三步法微珠制备三步法微珠制备nRaw BeadsSilanization nproduces a general coupling molecule an aminenTrimethoxy amino propyl silanenVery stable compared to other techniquesActivationnPrepares the bead to attach the OligonCyanuric ChloridenImmobilization of DNAnComplexitynDiscrete reactionsn96 Well microtiter plateNH2OHNNNNHClCl53n每种(微珠+探针)单独合成并 QCn不同种微珠混合在一起形成 微珠池微珠池 (1624 24,000+种微珠)寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针高杂交特异性高杂交特异性全长序列探针全长序列探针定制灵活定制灵活100%质量检控质量检控QC54Bead ProductionSynthesis of OligosActivated Bead Plates+Oligo Plates Gilson 96 Tip RobotOvenPooled Bead SetQC55acid etchstrandcladdingstrandcorePhoto-resistSilicon waferplasmaetchingcleaningOptical fiber3 m beads in wells芯片的组装芯片的组装56将微珠池内微珠倒入蚀刻光纤，微珠将微珠池内微珠倒入蚀刻光纤，微珠无无序自组装序自组装 进入小孔，每根光纤上带一个进入小孔，每根光纤上带一个微珠微珠每种微珠大约有每种微珠大约有 30 个重复个重复芯片的组装芯片的组装消除系统随机误差消除系统随机误差高重复性高重复性微珠之间间距均一微珠之间间距均一57光纤束光纤束-微珠微珠芯片的组装芯片的组装传统芯片图58Random Bead AssemblyMixture of Different Bead Types6x2 Whole Genome Bead ChipBead Pool is pipetted on the SubstrateNo Information of Bead Identity and location on Array59Decoder hybridization 1Decoder hybridization 2芯片解码芯片解码60n Gunderson et al.(2004)Decoding randomly ordered DNA arrays.Genome Research 14,870-877.4.芯片解码芯片解码61XY=total number of codesX=total number of colors or statesY=total number of hybridization stagesSingle IllumiCode StrategyExample:38=6,561 48=65,53662每张每张芯片上芯片上每个每个微珠微珠每个每个特性都被质控特性都被质控(100%QC)位置和强度控制位置和强度控制有多少重复有多少重复小部分不合格地被捡出小部分不合格地被捡出 是是Illumina 出厂前的生产步骤出厂前的生产步骤 每个芯片在出厂前已通过解码和质控每个芯片在出厂前已通过解码和质控解码解码 CD 随芯片送至用户处随芯片送至用户处芯片解码芯片解码63Decoding Quality Metricsn%of Beads Loaded:98%n%of Beads Decoded:98%nBead Type Representation:30 nError Rate:0.05%nPresence of all Bead TypesnDecoding Intensities of each stagenFocus MetricsnAll parameters monitored in real time64Decoding Quality Metrics65BeadArray FormatsSentrix Array MatrixSentrix BeadChip Formats Human-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-166BeadStation扫描系统 激光共聚焦扫描系统激光共聚焦扫描系统 高分辨率高分辨率,0.8 micron 双色激光双色激光 at 532&635 nm超高分辨率超高分辨率全自动化定位全自动化定位,扫描扫描67nConfocal laser scanning systemnSub-micron,0.8 micronnTwo lasers 532,635 nmnSupports Cy3&Cy5 imagingnAuto-focusing,centering and tilting without photo bleachingnSupports genotyping,gene expression applicationsnScans both Array Matrix and BeadChip microarrays68Analytical Fluorescent Image