科研技能重点

1、抗原修复:组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使 部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决 上述问题，利用化学试剂（蛋白酶等）和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来 的过程称为抗原修复。2、细胞培养（cell culture）：是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外模拟体 内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构 和功能特性。在体外条件下，模拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生长与增殖的技 术。3、基因：是位于染色体上的遗传功能单位，是编码蛋白质（酶）或RNA的一段双链DNA 片段。是控制生物性状的基本遗传单位。4、侧向散射光：入射激光60度或90度角的散射光信号（角度指的是激光束照射方向与收 集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度），主要用来获取有关细胞内 部精细结构的颗粒性质的有关信息。5、多克隆抗体：是指针对抗原上多个抗原决定簇产生的抗体，一般将抗原免疫动物后取血 清直接制备。6、分子生物学：在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子（核酸、蛋白质） 的结构、功能和生物合成等，阐明各种生命现象本质的科学。7、单克隆抗体：是指针对一种抗原决定簇产生的单一种类抗体，一般通过杂交瘤细胞技术 制备。单抗的结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有 编译，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。8、组织培养（Tissue culture）：把活体的一小片组织（O.51立方毫米）置于底物上孵育， 细胞自其周围移出并生长。9、生物材料的概念:生物材料用于人体组织和器官的诊断、修复或增进其功能的一类高技 术材料，即用于取代、修复活组织的天然或人造材料，其作用药物不可替代。（生物材 料能执行、增进或替换人体组织和器官因疾病、损伤等失去的某种功能，而不能恢复缺 陷部位。）10、器官培养（Organ culture）：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。1、细胞培养需要哪些基本条件？ 答：无菌条件：1、无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。2、（使用前）紫外照射3、 每周甲醛熏蒸和每月新洁尔灭擦拭地面一次的方式进行消毒2、超净工作台3、常用培养器皿的清洗及消毒4、火焰消毒：在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭 瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。5、消毒：压力蒸汽消毒器，电热干燥箱等。6、大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。细胞生长条件：1细胞的营养需要：碳水化合物、氨基酸和脂类三大类；也需要一定量的无机盐、维生素和 微量元素。无机盐对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。细胞培养的常用液体：水，平衡盐溶液，pH调节液，消化液，抗生素溶液，培养基 完全培养基的组成：基础培养基80%95%，血清5%20%（注：血清解冻采用逐步解 冻法），碳酸氢钠2.0 g/L,青、链霉素 各100U/ml2细胞的生存环境温度：37 C02C02: 5% C02 +H20 H2CO3 H+ + HC03-pH: 727.4渗透压3无污染4无毒细胞检测条件：细胞计数：计数结果以每毫升细胞数表示，细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血细胞计数器：手工计数细胞（注意：压线细胞只计左侧和上方的。Coulter计数仪：人工计数培养细胞活力测定：台盼蓝法-活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。流式细胞仪-细 胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。注意细胞培养的污染和检测。细胞保存条件：细胞深低温保存的基本原理是：在一80C以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢 处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键：在于通过020C阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针 状，极易招致细胞的严重损伤。冻存和复苏的原则：慢冻快融，慢冻可使细胞内不致产生大的冰晶。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 细胞欲冷冻保存时，注意细胞浓度。的规章制度，实验室应做好防火、防触电、防盗等工作。实验室安全：实验人员应严格遵守 实验室有关2、举例说明如何检测基因的表达？答：基因的表达包括基因的转录和翻译。其相对应的产物主要有mRNA, tRNA，蛋白质等， 假如我们需要测SPAG在人类睾丸中的表达研究，主要步骤如下：1、按照实验目的等选取合适的材料，本例为成人睾丸，隐睾。2、提取SPAG4L mRNA，提取mRNA时注意防止RNA酶污染。3、利用RT-PCR技术合成cDNA,再设计特异的引物，以睾丸cDNA为模板进行PCR扩增。4、用琼脂糖凝胶电泳等方法验证上述的PCR产物大小。5、将睾丸和隐睾组织进行固定、脱水、冰冻切片等处理。6、切片干透后用PCR产物做探针进行组织原位杂交检测，即可检测出SPAG4L在睾丸组 织中表达的情况。重点你们自己看一下，名词解释是里面出5个，问答那两个是必考的，还有三个是需要自己 主观作答的，稍微多看一下课件吧。流式细胞术是单个细胞/颗粒流过检测装置过程中，检测到的物理和或化学的特性。是一种 在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以高速分析细 胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。前向散射光：入射激光的同向散射光信号，其强度与细胞的大小有关。临床实际问题提出者：往往缺乏较好科研思维；不具备良好研究条件大量基础研究偏离临床实际：难以在临床上应用人类对疾病的认识：从机体表型来认识疾病即根据现象和检查所获知的症状与体征。从组 织细胞的病理、生理变化来分析和诊断疾病。不能从本质上真正认识疾病发生的根本原因, 不能从根本上治愈疾病和阐明疾病的发病机制。分子医学：由于分子生物学渗透进入生物学和医学的每一分支领域，全面推动了生命科学和 医学的各个方面的发展，如疾病的发病机理研究、疾病的诊断和治疗，使医学进入了一个崭 新的时代。高血压的分子分型的现状：基于肾素水平差异的高血压人群：低肾素可增加高血压发生的风险。高肾素型高血压 ACEI/ARB和B受体阻滞剂。低肾素型高血压：醛固酮抑制剂、钙拮抗剂和利尿剂。伴有交感神经兴奋升高的高血压人群伴有高同型半胱氨酸的高血压人群：Hey致高血压机制包括：1、损伤血管内皮细胞2、促 进血管平滑肌细胞增殖3、促使载脂蛋白在血管壁堆积，还有影响纤溶蛋白活性等4种假说 盐敏感型高血压基于新的分子标志物高血压分型基于遗传背景的高血压分型：可以采用表观遗传学方法研究。基于药物基因组学高血压分型临床应用的心脏标志物1. 反映心脏组织损伤的标志物：肌钙蛋白（心肌梗死）；BNP （心力衰竭）2. 了解心脏功能的标志物3. 作为心血管炎症疾病的标志物：CRP （动脉粥样硬化、血栓形成疾病的介导和标志物） 心脏标志物合理的联合应用，有利于提高心脏生物标志物临床应用的灵敏性和特异性 心脏利钠肽的主要临床用途有：1）鉴别心源性还是肺源性Q）评价心脏功能，判定心衰严 重程度（3）心血管疾病预后估计和危险性分类（4）治疗效果的监测,调整药物剂量（5）其 他，如高危人群筛查TM主要分为两类：肿瘤组织产生的和肿瘤与宿主相互作用而产生的1 .由肿瘤细胞分泌的标志物1）分化抗原标志物2）胚胎抗原标志物（AFP、CEA等）3）糖脂或糖蛋白类（CA19-9、CA15-3、CA242等）4）同工酶类标志物（NSE,PAP,CK-BB等）5）激素类标志物（HCGACTH等）6）肿瘤相关抗原（PSA，TPA等）7）基因类标志物（P53、C-MYC、BCL-2）8）其它：多胺、唾液酸等2. 宿主反应标志物:SF、B 2-MG、IL-2R、TNF3. 不进入体液的标志物TM的临床应用：普查：迄今为止还没有一种理想的TM-受限定位:不能定位-绝大多数TM都无器官特异性确诊：任何一种TM都存在假阳性和假阴性的问题分期：大多数TM与疾病的分期有关，且浓度与肿瘤的大小或分期有关系分型：部分已经显示有较好的分子分型与治疗关系：1）化疗、放疗或手术后立即测定TM浓度，可能会有短暂的升高，与肿瘤细 胞坏死相关2）化疗、放疗或手术后TM浓度持续恒定升高，可能表示治疗无效预后：部分TM对肿瘤具有预后价值，如术前TM浓度增加,术后浓度减低，则可能预后较好 基因芯片技术：将大量探针固定于支持物上，与标记的样品进行杂交。用途：基因表达谱分 析、基因突变检测、多态性分析、基因诊断等肝炎病毒基因的检测：病情评估：血清中病毒含量的多少与病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反 应程度越重疗效预测：治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大 遗传性疾病基因诊断的策略：（一）直接诊断策略：直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明，检测基 因的遗传缺陷，因而比较可靠（二）间接诊断策略：间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自 双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因基因导向一一个体化用药一一个体化医疗后基因组时代的工作：基因及其编码产物（主要是蛋白质）是如何单独和共同在生命过程中 发挥作用的。蛋白质组：一个细胞或一个机体基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式；从整体的角度分析、鉴定 细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间、蛋 白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。研究内容：了解某种 特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的 网络的；Pro的三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位 蛋白质组学的临床应用：1诊断：如疾病筛查、疾病分期分型等2指导治疗：如病程分析、用药、手术时机的选择等3提供药物开发的临床依据：如确定药物靶点、新药开发（某些药物本身就是蛋白质）等4. 预后判断：如根据生物标志物在不同疾病中的变化，从而判断疾病的性质和严重程度等 转化医学与4P医学：Predictive Medicine-预测医学：疾病概率史-DNA序列，定期体检和血液带白参数检测； Preventive Medicine -预防医学：生活方式的改变和避免危险因素，疫苗，重点在疗养； Personalized Medicine -个体化医学：根据个体的独特遗传变异，选择合适药物和治疗方 案，开发针对独特遗传变异人群的药物；Participate Medicine -参与医学：病人了解疾病并参与用药选择。核酸的分子生物学研究内容包括：核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核 酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。蛋白质的分子生物学一一蛋白质的结构与功能。细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的 各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而 使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与 该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的 研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最 迅速的领域之一。分子生物学的临床应用：亲子鉴定；基因诊断；产前诊断。胚胎移植前遗传学诊断（PGD）：从发育到4-8细胞的胚胎中，取出一个细胞进行细胞遗传 学或分子遗传学检查，再将检查正常的胚胎放到子宫中，以达到优生优育的目的。常见的DNA符号：gDNA （基因组DNA） plasmid DNA （质粒 DNA） mtDNA （线粒体 DNA） ssDNA（鮭鱼精 DNA）cDNA（互补 DNA）rDNA （核糖体DNA, rDNA就是可以转录产生rRNA的基因）T-DNA他叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构,T DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素） 在RN A病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。常见的RNA符号：mRNA 信使RNA：合成蛋白质的模板tRNA转运RNA： mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者rRNA核糖体RNA：是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。cRNA（互补RNA,可用分子作杂交探针）hnRNA（基因转录初产物,在细胞核内不稳定）RNAi, RNA 干扰shRNA短发夹RNAmiRNA （真核生物内源性的小分子单链RNA，通常18-25 nt长，能够与靶mRNA特异性的 碱基配对引起靶mRNA的降解）基因座（locus/loci）：每一对基因分别位于来自双亲的染色体的同一位置上，这个位置称为。 等位基因：一对同源染色体同一基因座上的一对基因称为一对等位基因（allele）。复等位基因：在一个群体中，每一个基因座位上可以有2个以上等位基因，这就是复等位基 因（multiple allele ）。假基因（pseudo gene）：与功能基因相似的序列，但由于突变等原因，不能转录或能转录但 不能剪接形成成熟mRNA分子。这些序列称为。超基因（super gene）：是指作用于一种性状或作用于一系列相关性状的几个紧密连锁的基因。 外显子：出现在成熟mRNA分子中的基因序列。内含子：不出现在成熟mRNA分子中的基因序列。课题设计与实验方法的选择：临床思维：疾病一表型一蛋白一基因型一基因一突变基础研究思路：基因f蛋白f功能f与疾病的关系f基因诊断/基因治疗检测的目的：突变、基因多态性、基因的表达、基因定位、基因表达调控、蛋白相互作 用等方法的选择：先了解目前检测都有哪些方法，根据实验目的、实验时间、经费选择合适的方法。PCR检测DNA； RT-PC 检测mRNA；组织原位杂交检测mRNA； IP 检测蛋白质之间的相互作用；Pull-down 检测蛋白质之间的相互作用；酵母双杂交 检测蛋白质之间的相互作用PCR技术：聚合酶链式反应(Polymease Chain Reaction， PCR)是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目 的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。技术原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的 参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。平台效应：指经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指 数增长，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。平台效应与下列因素有关：引物、dNTP浓度降低，掺入速度减慢酶与模板的比例下降：酶量减少，模板增加；产物的再结合PCR扩增中的基本成份:H20： 般采用双蒸水；PCR反应缓冲液；Mg2+(0.5-2.5mmol/L)； Taq酶(1-5U/100M )或其他聚合酶；底物(dNTP (20-200卩mol/L，等摩尔配制)：dATP, dTTP, dGTP, dCTP)；引物(0.1-0.5卩mol/L)；模板(100-200ng/100pl)。引物设计应遵循以下原则：1)引物长度及碱基分布：引物长度一般为15- 30bp，常用为20bp左右。ATCG最好随机 分布，避免5个以上的嘌吟或嘧啶核苷酸的成串排列。(2) G+C含量：以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。(3) 引物自身及引物之间：避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3 端的互补，否则会形成引物二聚体，影响引物与模板的复性结合。(4) 严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。PCR产物的检测方法：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳法；直接测序；分子杂交； 限制性内切酶酶切分析。RT-PCR 为反转录 PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR),由一条 RNA 单链转录为互补 DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通 常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下cDNA。RT-PCR优点：1.基因的组织表达谱；2.灵敏性高3.操作简单 缺点：1.不能反映基因的原位表达情况；2不能反映基因的真实大小；3不能反映基因有几个转录本;4.有时会出现假阳性。问题可能原因解决方法产量太低样本裂解或匀浆不充分延长匀浆时间RNA沉淀溶解不充分65C加热可促进溶解A260/A2801.65匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小增加RNA抽提试剂用量匀浆后，样本没有静置室温静置5分钟，促进裂解反应水相中可能有酚残留吸取上清时应注意操作的正确性测比值时，RNA溶解在DEPC水中，低的离子浓度比值时，采用TE溶液溶解RNA和PH值增加了280nm的吸光值取样操作不正确取样后应立即抽提和冻存RNA 降解样本保存不当80 C或液氮保存液相中可能有RNA酶污染采用RNA抑制剂制胶时所用甲醛的PH值小于3.5试剂新鲜配制DNA污染匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小增加抽提液用量蛋白、多糖污染抽提时蛋白和多糖去除不彻底RNA沉淀时，加入部分盐溶液, 选择性沉淀RNAWestern blot:基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着 色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的 信息。被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。步骤：1）蛋白样品制备：（1）细胞蛋白提取；（2）组织蛋白提取。2） SDSPAGE电泳 3）转膜：4）封闭5） 抗杂交6）洗脱 7）二抗杂交 8）洗脱 9）显色、照相。原位杂交：原位核酸分子杂交技术简称原位杂交技术。是用标记的DNA或RNA为探针， 在原位检测组织细胞内待定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分 为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。医学研究中实验手段大致分三类，但有相互关联一、形态学研究形态学是生命科学的基础学科，目的是描述生物组织和细胞的形态并研究其规律。研究 内容无不涉及到医学各个学科，研究技术是生命科学研究领域中最基本、最重要和应用最广 泛的手段，包括细胞与组织病理学、超微结构观察和亚细胞抗原定位，免疫组织化学和原位 杂交方法检测抗原以及组织培养等技术。二、溶质性分子检测与分析研究实验：（略）分子生物学、免疫学和生物化学方法，如蛋白化学、核酸化学、蛋白组学和基因组学等 定量检测技术。三、动物实验研究（略）以动物为模型，观察实验因素在体内的影响过程，包括行为学检测以及实验动物手术学等。 形态病理学与免疫组化实验环节：一、建立实验模型，正确处理细胞与组织标本1、动物模型建立，不能忽略各组的动物样本量，并设计合适的实验组、对照组，注意动物 饲养过程及实验记录。2、动物取材要清楚动物解剖结构，形态学与分子生物学实验取材兼顾，组织块大小以及组 织块的固定。3、临床取材，标本主要来自病人，组织少而珍贵，均需小心操作。活检钳刃口必须锋利 取材在主要病变区取病灶与正常组织交界区必要时取远距病灶区的正常组织作阴性对照。4、取材参考部位。血管：因斑块不在同一部位，所以需取45个节段才合理。肝脏： 左右分四叶，取材一般在肝脏右前叶或左外叶中部，也可根据实验设计要求来取组织。胰腺 和胃：取材胰腺尾部（胰岛多），取材要将胰腺周围的脂肪组织去掉，以免影响固定，胃一 般取胃体和底（胃腺多）或幽门部。肾脏：固定全肾24小时后，行肾的中部纵剖切面， 然后在肾的任一半面做扇形切面，皮、髓质都应切到。肺賍：不取肺边缘，肺小叶的中部 结构较好，一般作横切面。脊髓：一般取腰膨大，并连同双侧的脊神经节取下，平置于滤纸 上，可带滤纸固定。眼球：整体取材，细心的剥离，注意勿损伤眼球壁，切断视神经保留 0.5厘米，眼球取出，将固定液从后房注入，眼球一般都用火棉胶切片。内耳：取整个内 耳，注射法固定后，再投入固定液固定。一般作外耳道水平切片，观察其全部结构，切片时 要注意柯替氏器的完整。5、培养的组织或细胞标本处理：培养的贴壁细胞可做成爬片，薄组织（耳蜗）可做成铺片。 小物体可用琼脂+石蜡包埋。悬浮细胞可用涂片法检测，也可琼脂加温包埋高速离心后，再 用电镜方法包埋。二、相应抗体与相关试剂的筛选正确选择与相关免疫宿主匹配的抗体。检测相关蛋白片断、多肽或全长蛋白，则必须选择 相应免疫原制备出的抗体。用流式细胞术（FACS）检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含 该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体选择一抗与样本物种应不同，从而避免二抗与样本内 源性免疫球蛋白产生交叉反应。三、掌握病理学和免疫组化的实验技能1、标本固定。使细胞内物质尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置。免疫组化和原位 杂交还需保持组织或细胞的抗原性不失活、不发生弥散。2、免疫组织化学染色方法。直接法，间接法，AP法与双PAP法。3、双重染色抗体的选择。要求：一抗无偶联，来源于不同物种；二抗分别识别一抗，二抗 说明书应描述有无交叉吸附。四、形态学实验结果观察与判断1、观察一抗的特异性标记部位。看其是否在特定的部位，是否为非特异性染色等。五、图片采集与统计分析以及论文制图免疫组化是借助颜色反应来证实抗原抗体结合部位。原理：一抗加二抗再加生物素和卵白素 （ABC）在过氧化酶（HRP）作用下，电子从反应物DAB转移到过氧化物而产生不可溶的 棕色产物。作用液必须新鲜配制。HEPES缓冲液：是一种氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒定的pH范围。 通常使用浓度为1015mM, 般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。胰蛋白酶溶液：主要作用：水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋 白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。胶原酶溶液：水解结缔组织中胶原蛋白成分，而对上皮细胞影响不大。胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别:项目胰蛋白酶胶原酶消化特性消化软组织用量0.01%0.5%消化时间0.52hpH89作用强度强烈细胞影响时间过长有影响消化纤维多的组织0.10.3 mg/mL （200 U/mL）1 12h6.57.0缓和无大影响血清抑活有无Ca2+和Mg2+有影响无影响合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物 质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum)是指小牛血清,HS (horse serum)是 指马血清每代贴壁细胞的生长过程：1、游离期：悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。2、吸附期：贴附底物，一般24小时内贴壁。3、潜伏期：此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为624小时。4、对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。5、停止期(平台期)：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度 依赖性贴附生长型细胞：上皮样细胞，成纤维细胞样细胞，悬浮生长型细胞：血，脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞。特点：在悬浮中生长良好的细 胞，圆形。优点：生存空间大，提供数量大，传代方便，易于收获，可获得稳定状态。缺点： 观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)细胞传代方法：1. 悬浮生长细胞传代离心法传代：离心(1000转/分)去上清，沉淀物加新培养液后再混 匀传代。2. 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液是0.25%的胰蛋白酶液 首次传代注意事项：1、细胞生长密度不高时，不能急于传代2、原代培养的贴壁细胞需控制消化时间3、吹打已消化的细胞应减少机械损伤4、首次传代时细胞接种数量要多一些5、首次传代培养的pH应偏低些6、小牛血清浓度可加大至15%20%左右原代培养：取体内新鲜组织，并置于体外条件下生长的细胞，在传代之前称为原代培养。、 优点：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状 态。传代：原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大， 导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。细胞 在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。传代注意事项：接种数量为5 X 1048 X 105个/ml。传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。细胞系cell line：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。细胞株(cell strain )：由具有某些特性与标志的细胞，经选择或克隆化而派生的亚系，这 些特性或标志在后续的培养中一直保持下去的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与 原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。实验法:是指研究者根据课题研究的目的任务，通过科学仪器和设备在有目的地干预,控制或 模拟所研究的事物，以便在最有利的条件下对其进行观察，从而获得科学事实的研究方法。 实验法的类型:定量实验，定性实验和对照实验。实验方案:是指对所要进行的实验过程预先作出的理论设计。其内容主要包括:题目；目的;方法;实验时间;受试对象;施加因素;观察指标;实验步骤;科学事实 记录;数据处理方法;设备仪器等。实验实施：1.实验目的；2实验材料；3实验方法；4实验步骤；5数据记录、处理和分析；6. 实验结果和结论选题的原则（目的）中南大学ET家系同源比较ET病例已知候选基突变检1鉴定疾病基:位疾病基既连锁分休型分析常对照定易感基科学实验是人们根据一定的研究目的，运用一定的物质手段，在人为地控制或模拟自然现 象的条件下，使由然过程或生产过程.以纯粹的、典型的形式表现出来，暴露它们在天然条 件下无法暴露的特性，以便进行观察、研究、探索自然界的本质及其规律的一种研究方法。 优点：实验能够更大地发挥人的主观能动性实验能够达到科学研究的目的性实验能够证明 客观必然性常见的实验类型：定性实验，定量实验，因析实验，对照实验，模拟实验。单盲（single blind）：研究对象不知分组情况双盲（double blind）：研究对象、研究者不知分组情况三盲（triple blind）：研究对、研究者、负责资料收集者不知分组情况处理实验数据的工具主要有记录表、柱形图、曲线图等。数据经图表处理后，能更清楚地看 出它们存在什么规律和趋势，因而更容易对数据进行分析和总结，发现实验数据所说明的问 题，以便得出实验结论。要求：结果真实，结论严谨。实验结果是对实验现象的客观记录，实验结论是对实验结果的主观能动性的思考生物材料是一种不同于工农业商品的特殊产品：质量的好坏直接关系到患者的生命安全，故 生物材料用于临床之前预测性评估其用于人体安全性的至关重要。生物学评价基本原则：1. 标准：参照GB/T16886.1-ISO10993.1评价试验指南要求选择试验项目2. 生物学试验应先体外再体内3. 符合GLP专业实验室和专业技术人员4评价结论强调综合分析5被评价的对象应处于“使用”状态6正确区分“评价”与“试验”7需考虑除原材料以外的诸多因素8评价前需确定器械的作用类型、接触性质、程度、时间和频次等 基本评价试验内容（8大项）1细胞毒性采用细胞培养技术。测定由器械、材料和/或其浸提液造成的细胞溶解（细 胞死亡）以及对细胞生长的抑制和其他影响。2致敏采用一种适宜的模型测定器械、材料和/或其浸提液潜在的接触致敏性。3、刺激采用一种适宜的模型，在相应的部位或在皮肤、眼、粘膜等植入组织上测定器 械、材料和/或其浸提液潜在的刺激作用。皮内反应：评价组织对器械浸提液的局部作用。 该试验适用于不适宜做表皮或粘膜刺激试验的情况（如连向血路的器械）还适用于亲水性浸 提物。4、全身毒性（急性）将器械、材料和/或其浸提液在24 h内一次或多次作用于一种动 物模型，测定其潜在的危害作用。该试验适用于接触会导致有毒的沥滤物和降解产物吸收的 情况。该试验还包括热原试验，检测器械或材料浸提液的材料致热反应。5、亚急性和亚慢性毒性在大于24小时但不超过试验动物寿命的10%的时间（如大鼠 是90日）内，测定器械、材料和/或其浸提液一次或多次作用或接触对试验动物的影响。6、遗传毒性采用哺乳动物或非哺乳动物的细胞培养或其他技术，测定由器械、材料和/或其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变，以及DNA或基因的其他毒性。7、植入（肌肉、皮下和骨）一一用外科手术法，将材料或最终产品的样品植入或放入预定 植入部位或组织内，在肉眼观察和显微镜检查下，评价对活体组织的局部病理作用。8、血液相容性：体外、体内外循环和体内 评价血液接触器械、材料或一相应的模型或系 统对血液或血液成分的作用。溶血试验采用体外法测定由器械、材料和/或其浸提液导致的 红细胞溶解和血红蛋白释放的程度。补充评价试验内容（4大项）特点：试验对象具有针对性试验周期相对较长、费用较高项目：慢性毒性（超出90d）：在不少于试验动物寿命10%（如大鼠是90日以上）的时间 内，一次或多次将器械、材料和/或其浸提液作用于试验动物，测定其对动物的影响。致癌性：在试验动物的寿命期内，一次或多次将器械、材料和/或其浸提液作用于 试验动物，测定潜在的致肿瘤性。试验应与接触途径和作用时间相适应。生殖与发育毒性：评价器械、材料和y或其浸提液对生殖功能、胚胎发育（致畸性）, 以及对胎儿和婴儿早期发育的潜在影响。试验应考虑器械的应用位置。生物降解：在存在潜在的可吸收和/或降解时，该试验可测定器械、材料和/或其浸 提液的可沥滤物和降解产物的吸收、分布、生物转化和消除的过程。举例：1、一次性使用静脉留置针应选择哪些生物学试验？细胞毒性/致敏/皮内刺激急性全身毒性/亚急性全身毒性（静脉）热原试验/遗传毒性（3项）肌肉植入（24周）/溶血/凝血/血小板2、脱细胞异种皮细胞毒性/皮内刺激/致敏/急性（亚急性）全身毒性/热原/遗传毒性/免疫毒性3、节育器应选择哪些生物学试验？细胞毒性/致敏/阴道黏膜刺激 急性全身毒性/ （亚）慢性全身毒性热原试验/遗传毒性（3项）肌肉植入（612月）/致癌性生殖与发育毒性4、降解类骨种植体应选择哪些生物学试验？细胞毒性/致敏/皮内刺激急性全身毒性/ （亚）慢性全身毒性热原试验/遗传毒性（3项）骨植入（612月）/生物降解/致癌性5、血管支架细胞毒性/致敏/皮内刺激/ 急性全身毒性/ （亚）慢性全身毒性/热原试验/遗传毒性（3项）/肌肉植入（6 12月）/溶血/凝血/血小板/血栓形成/白细胞/补体