生化实验指导

生物化学实验指导海洋学院生物化学课程组编2011年8月10日目 录实验室守则 海洋学院实验记录的基本要求 实验报告撰写要求 实验一 糖类的定量测定 1实验二 纸层析法分析氨基酸 3实验三 氨基酸含量的测定 6实验四 蛋白质的两性性质及等电点的测定 8实验五 考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量 10实验六 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法 13实验七 DNA的提取制备 23实验八 酶活性的测定 26实验九 过氧化物酶同工酶分析 29实验十 凝胶层析 33实验十一 酪蛋白的制备 36实验室守则一、安全卫生1. 所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器操作和维护的义务。2. 在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用物品归还原位， 立即将所使用过的试验台、实验用品等清洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。3. 实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验室后进行检查，必须保持实验室内环境整洁，走道畅通，设备器材摆放整齐。4. 禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。5. 最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。二、仪器使用1. 严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。2. 对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格按照要求操作，每天应在晚上十点前关闭。3. 烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱。不能用不干净的抹布擦烘箱。4. 使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放置。5. 天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使用完毕后应立即清扫天平，以免化学试剂腐蚀天平。6. 不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐蚀。 7. 气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力(如氧气不少于2 Kg/m2)。8. 有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。9. 实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准随便倾倒或倒入水池中。10. 超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮盖前面板。11. 冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。三、实验数据及其处理1. 所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，如样品应有样品名称、存放时间、存放人。配制的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人等。2. 必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。数据图须标有误差棒。3. 实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，二星期内完成实验结果整理，正确处理实验数据，不得更改原始数据。海洋学院实验记录的基本要求一、实验记录的内容：实验记录的内容通常包括实验设计、实验名称、时间、试验者、实验材料、实验步骤、观察指标、实验结果、和结果的初步分析等内容。1、实验设计：实验记录的首页必须有一份科学规范的实验设计，实验设计的具体格式和规范另行要求。2、实验名称：首次实验记录必须注明课题名称和试验名称。3、实验时间：每次实验记录必须在记录纸的左上方按年、月、日顺序记录实验的日期和时间，如：11-08-05 8:00-11:00。4、实验方法：常规实验方法应在首次实验记录是注明方法的来源，详细记录实验的具体操作步骤。创新或改进的实验方法应当给出创新和改进的依据，并详细记录实验过程中的一切现象和具体的实验操作的细节。5、实验材料：详细记录所采用的仪器设备名称、型号、生产厂家及其度量精度。实验动物和试验植物种属、来源及品系；主要试剂的生产厂家、规格型号和生产批号，自制的实际应在首次记录中详细说明配制方法、时间及保存条件，试验若有变更，应在相应的实验记录中加以说明。6、实验环境：对环境条件敏感的试验，要详细记录实验当天的天气情况和诸如光照、通风、温度及湿度等实验微小气候。7、实验结果：应当准确记录定量观察指标的实验数据和定型观察指标的实验变化。在不同的时间点上，从同一个受试对象上观察来的数据，必须写在与实践对应的位置上，不得错位。8、结果分析：每次实验结果应作明确地的文字小节，如有图片（如序列图、电永图谱、照片等）则附必要的文字说明，对与预期结果不符合的结果，要详细分析原因。9、 实验人员：应记录所有参加实验的人员。二、实验记录的书写：实验记录要用兰黑或碳素墨水、字迹工整、内容清楚、整洁。必须使用中文记录，不得使用外文和中文混记，不得使用自造的字或不规范的简化字。必须使用规范化的专业术语和国际标准计量单位。常用的英文缩写必须符合规范并已经出版界得到认可，首次出现的缩写必须用中文加以注释。实验记录中属译文的必须用括号注明其外文名称。实验图片、照片应当用胶水贴在记录的相应位置。底片装在统一制作的袋内，编号后用胶水贴在照片旁，不得贴在其他位置。除一次成像和仪器打印的外，不得有图片而无底片。实验记录必须及时准确，不得写回忆性记录，不得伪造、编造实验记录。每次实验后，实验负责人和记录人要在记录上签名，课题负责人要定期检查实验记录，并签署检查意见。三、实验记录的修改：实验记录不得随意删除、修改和增加数据，如系写错确需修改，在需要修改处下面划一条横线，不可完全涂黑，保证修高前后记录能够辨认，修改人必须签字。凡进入实验室从事实验的同学必须遵守以上要求。实验报告撰写要求实验报告是从理论、方法和实践三个方面对实验工作的总结，是实验课程学习的重要环节。撰写实验报告主要有两个目的。一是通过对实验项目的目的、原理、实验仪器和材料、操作步骤的科学描述以及对实验结果的记录、处理、分析和讨论，加深学生对基本理论的认识和理解，培养学生分析问题和解决问题的能力。二是通过撰写实验报告，促使学生寻找自己实验过程中的问题和漏洞，改进今后实验工作，提高实践能力，拓宽创新视野。因此，实验者必须各自独立思考完成实验报告，不允许抄袭书本、讲义或相互抄袭。为进一步规范实验教学管理，提高实验教学质量，对学生实验报告的撰写提出以下基本要求。1、实验报告使用学校统一印制的实验报告纸撰写。实验报告简单通项如姓名、学号、班级、课程名称、实验项目、同实验者、指导教师、日期等必须填写正确齐全，不得错漏。实验项目名称统一使用“实验一、”形式。2、实验目的一项主要写三个方面的内容：实验的背景材料、为什么做本实验或本实验要达到的目标以及本实验的拓展应用。3、主要仪器设备及材料一项清楚记载实验中需要的仪器、设备和实验材料细项，要尽可能令读者能重复本实验，并对特殊的装置给予图示。4、实验原理与步骤部分写作时将原理和步骤分开撰写。撰写原理时要在充分理解讲义或实验指导书载明的理论基础上，自己组织语言进行叙述，要求做到简明扼要，语句通顺，要求独立完成，严禁抄袭；实验步骤要条理清楚，图表文字详实，要求写出实验者自己的实验步骤，不得抄袭讲义或实验指导书上的文句，使读者依据此处记载的实验步骤能重复出实验。实验步骤主要包括: 供试的条件、数量、取样方法；实验的设计，实验组与控制组情况，实验中自变量因素的实施及条件控制等；实验步骤的具体过程、实验时间的安排以及注意事项等；杜绝抄袭。5、原始实验数据记录要详实具体，应当准确记录定量观察指标的实验数据和定性观察指标的实验变化。定量的实验数据记录必须指代明确，要说明在什么条件下得出的数据，不得出现“无头”数据。定性的实验变化描述必须定义明白，要说明在什么情况下出现的变化，不得出现“无根”的描述。原始数据记录要注明主要测量仪器的型号、量程和准确度等级等。记录必须使用规范化的专业术语和国际标准计量单位。常用的英文缩写必须符合规范，首次出现的缩写必须用中文加以注释。6、非定量实验结果的记录按照实验要求采用绘图或文字描述方式进行。实验绘图如生物实验图不同于一般美术图，也不同于机械制图。绘图要求将标本的外形和内部结构准确的描画下来，然后详加说明，要求形象自然，比例适当，线条清晰。生物绘图一般用点、线表示，轮廓用线条描绘，明暗程度、物质含量多少等则用细点的疏密表示，图纸应选择能够用橡皮擦拭的优质白纸，绘图时先用中软（EB）铅笔绘出轮廓，然后用较硬（3H）的铅笔绘出全图，图中各部分应注字说明，图与字之间用水平细线连系，图的标题填在图的下方。7、数据处理和结果分析部分撰写时应将数据处理和结果分析分开。数据处理因方法不同要求不同，对常见的数据处理方法分述如下：列表法：表格的设计要求对应关系清楚、简单明了、有利于发现相关量之间的关系；要求在标题栏中注明物理量名称、符号、数量级和单位等；根据需要还可以列出除数据以外的计算栏目和统计栏目等；要求写明表格名称、有关环境条件参数如温度、湿度等。作图法：作图必须用坐标纸，按需要可以选用毫米方格纸、半对数坐标纸、对数坐标纸或极坐标纸等；坐标轴选用以横轴代表自变量，纵轴代表因变量，在轴的中部注明物理量的名称符号及其单位，单位加括号；坐标分度要保证图上观测点的坐标读数的有效数字位数与实验数据的有效数字位数相同；根据实验数据用削尖的硬铅笔在图上描点，点子可用“”、“”、“”等符号表示，符号在图上的大小应与该两物理量的不确定度大小相当。点子要清晰，不能用图线盖过点子。连线时要纵观所有数据点的变化趋势，用曲线板连出光滑而细的曲线（如系直线可用直尺），连线不能通过的偏差较大的那些观测点，应均匀地分布于图线的两侧；在图纸的上部空旷处写出图名和实验条件等。也可以使用最小二乘法和逐差法进行数据处理。结果分析讨论是对实验结果的含义和意义进行评价。实验者根据实验的客观事实和结论，结合自己的认识与了解，通过分析思考，讨论和分析与实验结果有关的问题。结果分析主要包括：对实验结果进行理论上的分析和论证；对自己做实验的规范性和失误进行探讨，如对实验误差、出现和常识相违的数据或现象等进行必要的反省，对实验结果的可靠程度和适用范围作进一步说明；对实验方法的可靠性和局限性进行探讨，提出可供深入研究的问题以及本实验中尚未解决或需要进一步解决的问题，对未来的实验方法的改进提出合理的建议。结果分析后要有一个简洁的结论。8、实验报告撰写的最后部分是回答每次实验后教师留下的思考题。思考题的回答必须展开回答，详实具体，要求叙理有据、条理清楚、文字工整，并且是独立思考完成的。实验一 糖类的定量测定一、实验目的香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材上的真菌类，它含有大量的氨基酸等对人体有益的营养物质，还含有很多的多糖。香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。本实验学习香菇水溶性糖类的提取及定量测定方法。二、实验原理香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）经强酸脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮反应生成蓝绿色的糠醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。反应式：该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。三、实验仪器及试剂1仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2试剂：（1）2g/L蒽酮试剂：称取2g蒽酮（AR）溶于1000ml的浓硫酸中，当日配置使用。（2）1葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在80下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（3）100ug/ml糖标准液：精确吸取1葡萄糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。四、实验步骤1标准曲线的制作：取20mL刻度试管11支，从010分别编号，按表11加入溶液和水，加标准糖液0.0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60，用水补足至2ml，然后向试管内加入8.00mL 蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。2可溶性糖的提取： 取干或新鲜香菇子实体，擦净表面污物，粉碎，称取1.0g，用80-90热水30ml，在80-90恒温水浴锅中提取30分钟，4000 rpm离心10分钟。收集上清液，沉淀重复提取一次，合并两次上清液，用循环水真空泵抽滤除去漂浮物。吸取滤液1.0ml稀释至100 ml，得待测样液。3测定：吸取2.0mL样品液于试管中（重复2次），向试管内加入8.00mL 蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。糖的含量（CnV）/（W）式中：C一标准方程求得糖量（ug）；n一稀释倍数；V提取液量（mL）；一吸取样品液体积（mL）；W一（g）五、思考题1、简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖的基本原理。2、干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？怎样避免？实验二 纸层析法分析氨基酸一、实验目的1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。二、实验原理纸上层析是一种比较简单的色层层析法，这种方法所依据的原理就是利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同而达到分离的目的。实验是在特制的滤纸上进行。滤纸可视作惰性载体，吸附在滤纸上的水作为固定相，而有机溶剂作流动相。将要分离的混合物点在滤纸的一端，随着展开剂的移动，由于各组分在两相中的分配系数不同，各组分就以不同速度在滤纸上随展开剂移动。展开剂停止移动，各组分就停留在滤纸的不同位置上。若各组分无色，可根据其性质。喷上显色剂，以观察斑点的位置。用Rf值表示各组分的移动率：a为各组分移动的距离，b为溶剂移动的距离。各组分的Rf值随实验条件而变化，因此在鉴定时常常采用标准样品对照。此法一般适用于微量有机物质（5500微克）的定性分析，分离出来的色点也能用比色方法定量。三、实验仪器及试剂1、仪器：色谱缸（或带木塞和挂钩的试剂瓶）、直尺、铅笔、新华一号滤纸量筒、喷雾器、点样毛细管。2、试剂：1.0gL-1天冬氨酸、1.0gL-1蛋氨酸 1.0gL-1 亮氨酸展开剂（正丁醇:甲酸:水=15:3:2）、0.1%茚三铜丙酮溶液。四、实验步骤1、点样取1215厘米层析滤纸一张，在距下端1.5cm处用铅笔轻轻画一条与下端平行的直线，作为原点线；距原点线10厘米处再画一平行线，作为溶剂前沿线。在原点线上用铅笔每隔2.3cm处画一小圆圈，做为点样的位置。用毛细管点样：每种5-20ul为宜。点样的斑点直径不要超过0.3cm。在整个操作过程中，手和其它物质不要接触滤纸的层析部分（即展开相流经的部分）。2、展开将滤纸缝线成筒状，竖直放入层析缸中，先使滤纸不接触展开剂。在展开剂（正丁醇：甲酸：水=15：3：2）的蒸气中饱和20分钟。然后使滤纸浸入展开剂约1cm。展开剂沿纸而上升，当达到前沿线时，取出滤纸，拆线，立即用铅笔划出溶剂前沿位置，晾干。3、显色将滤纸干燥，向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮的丙酮溶液，干燥后，电吹风吹干，用铅笔描出斑点形状。用尺测算各斑点的Rf值，判断混合物中含有什么氨基酸。五、 思考题（1）纸层析法的特征和用途是什么？（2）影响Rf值大小的因素有哪些？（3）展开前为什么需要一个饱和过程？附：薄层层析法分离氨基酸一、实验目的1把握薄层层析的基本原理。2练习薄层板的制备。二、实验原理 薄层层析法是一种检验微量物质的快速准确的分析分离手段。它是将某种吸附剂在一块玻璃板（或硬质塑料板等）上铺成均匀的薄层，把要分离鉴定的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的层析缸内用适宜的溶剂（即展开剂）展开，从而进行层析分析的方法。 吸附剂对被吸附化合物的吸附能力有强弱之分，这与吸附剂本身的性质和被吸附化合物的性质是有关的。当被测样品随着展开剂在吸附剂上前进时，由于不同化合物具有不同的结构和性质，展开剂对它们的洗脱力和它们在吸附剂上的吸附、解吸附的性能也就有所不同，因而在吸附剂上移动的距离也就不会相同，这样就达到了分离的目的。 在薄层层析中为了获得良好的分离效果必须选择适当的吸附剂和展开剂。吸附剂含水较多时吸附能力就会大为减弱，因此使用吸附剂时一般要先进行加热去水的活化处理。在薄层层析中所用的吸附剂种类很多，用得最广泛的是氧化铝和硅胶。化合物被吸附剂吸附后，要选择适宜的溶剂进行展开。展开剂是一种或两种以上溶剂按一定比例组成的溶剂系统。溶剂的选择通常是根据被测物中各成份的极性、溶解度以及吸附剂活性和分离效果等因素来考虑，否则会影响吸附剂活性和分离效果。 观察层析结果时，假如化合物本身有颜色，可直接观察他的斑点。如本身无色，可用显色剂显色。不同物质所用显色剂是不同的。假如被测物质是有机化合物，一般都可采用碘蒸气进行显色。本实验中采用的是茚三酮显色剂。三、实验步骤1薄层板的制备 将10g硅胶G和15mL水在小烧杯内迅速混合均匀，再加入5mL水继续搅拌。将调好的糊状物倒在洗净干燥好的玻璃板上，用手摇摆，使其表面均匀光滑，厚度在0.251mm间为宜。在室温下晾干后，置于烘箱内慢慢升温，在105110下活化约半小时。取出后放于干燥器内备用。所配制的硅胶乳状液可制备薄层板35块。2茚三酮显色剂的制备 0.2%茚三酮异丙醇溶液3氨基酸的分离和鉴定 用毛细管分别取甘氨酸、缬氨酸溶液（各约1.00mg/mL）在薄层板上一端约0.5cm处点样。如在一块板上点二个样，则它们之间必须相隔一定距离；另取甘氨酸和缬氨酸混合溶液（0.5mg/L）点在另一块薄层板上，点样完毕。等斑点干燥后小心地将板置于盛有展开剂（水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5）的层析缸内，点样端浸入展开剂深度约0.3cm为宜。待展开剂上升了10cm以上后，可停止展开。取出薄层板，在前沿线处用大头针轻轻穿刺薄层作出记号。等板晾干后，在110烘箱内干燥大约10分钟，然后用喷雾器均匀地喷上茚三酮显色剂，再放入烘箱内烘烤约15分钟，即可显出各析层斑点。分别测出氨基酸的Rf值，并推断它们相互混合时能否进行层析分离。实验三 氨基酸含量的测定一、目的学习茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理，学会具体的操作方法，了解本方法的应用。二、原理氨基酸在一定pH范围内能与茚三酮溶液生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm 处的光密度，测定氨基酸的含量。三、 实验仪器及试剂（1）标准氨基酸溶液：配制成200ug/mL 溶液。（2）pH8.04磷酸缓冲液：称磷酸二氢钾4.5350克定容500ml；称磷酸氢二钠11.9380克定容500ml.取磷酸二氢钾10ml和磷酸氢二钠190ml混合即pH8.04磷酸缓冲液（3）0.2%茚三酮显色液：称取1g 茚三酮溶于35ml热水，加入40mgSnCl2.H2O搅拌过滤，滤液于冷暗处过夜，定容50ml .（4）样品液：每毫升含0.550g 氨基酸。（5）分光光度计。（6）水浴锅。四、操作步骤1、标准曲线的制作分别取标准氨基酸溶液0，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6mL 于比色管中，用水补足至4mL。各加入1mL缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100沸水浴中加热15min，冷却定容25ml。放置15min 后，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。2、氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入水3ml，缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100沸水浴中加热15min，冷却定容25ml。放置15min 后，摇匀后测定OD570nm。将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。五、 结果计算OD570nm对应标准曲线查得值氨基酸含量（ug/g）=样品克数六、思考题1茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？实验四 蛋白质的两性性质及等电点的测定一、目的要求（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。二、实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端氨基与C端羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阳离子 两性离子 阴离子 pH pI电场中： 移向阴极 不移动 移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。三、实验器材及试剂 1、试剂错误！未找到引用源。1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml； 错误！未找到引用源。 0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml； 错误！未找到引用源。 0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml； 错误！未找到引用源。0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L NaOH；错误！未找到引用源。0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸；错误！未找到引用源。0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml 1mol/L NaOH，然后加水至50ml； 错误！未找到引用源。0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/L NaOH 5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀；2、器材试管架，试管：15ml6，刻度吸管：1ml4，2ml4，10ml2，胶头吸管2。四、操作方法1、蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白1ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。（2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加边摇知道有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。（3）续加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。（4）滴加0.2mol/L NaOH 进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。2、酪蛋白等电点的测定（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂：试剂（ml）管号12345671.0mol/L 乙酸1.60.8000000.1mol/L 乙酸00410000.01mol/L 乙酸00002.51.250.62H2O2.43.2031.52.753.38溶液的pH3.53.84.14.75.35.65.9（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。（3）用-、+、+、+等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。五、思考题：1解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。2该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？实验五 考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理，学会测定蛋白质的方法，了解本方法的具体应用范围。二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三、实验器材及试剂1实验材料：新鲜绿豆芽2主要仪器（1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵（5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计3试剂（1）100g/ml牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100 mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000gmL 的原液。用时稀释10倍得100g/ml。（2）乙醇 （3）磷酸（85,WV）（4）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90乙醇中，加入85的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。四、操作步骤1、标准曲线制作（1）0-100gmL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作管 号123456标准蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10蒸馏水（mL）1.000.980.960.940.920.90考马斯亮蓝试剂（mL）555555蛋白质含量（g）020406080100OD595nm（2）0-1 000gmL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0-1 000gmL 的标准曲线。表2 高浓度标准曲线制作管号789101112标准蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂（mL）555555蛋白质含量（g）02004006008001000OD595nm2、样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5-1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃沉淀，上清转入10mL 容量瓶，以蒸馏水定容至刻度，得待测样品提取液。（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.2mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（g）。以标准曲线1 号试管做空白。表3 待测液蛋白质浓度测定管 号1314蛋白质待测样品提取液（mL）0.20.2蒸馏水（mL）0.80.8考马斯亮蓝G-250试剂（mL）55OD595nm蛋白质含量（g）五、结果计算X提取液总体积（mL）测定时取样体积（mL）样品蛋白质含量（g / g 鲜重）=样品鲜重（g）式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。六、附 注1Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。3蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。七、思考题1、考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量应该注意些什么？ 2、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？实验六 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、目的要求 (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 (2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。二、实验原理1、电泳的概念带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。多年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。利用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分利率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。2、电泳具有的特点凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析 样品量极少 设备简单 操作简便 分辨率高 便于观察、记录和保存。3、电泳的基本原理在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响：颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，解离强度的难易等。所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。应用电场的性质，如：电场强度。不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下：=v/E=dL/Ut 式中： 是迁移率；v 是颗粒迁移速度（cm/s或min）；E 是电场强度或电势梯度（V/cm）；d 是颗粒移动距离（cm）；L 是支持物的有效长度（cm）；U 是支持物两端实际电压（V）；t 是通电时间。颗粒的迁移率可通过测量d 、I、U、t 计算出。 影响迁移率的主要因素具体讨论如下：（1）带电颗粒的性质 即净电荷数量，颗粒大小及形状。一般来说，颗粒带净电荷多，直径小而近于球形，则泳动速度快，反之则慢。 物质在电场中所受到的力（F）为：FEQ 式中：E是电场强度，即单位长度支持物的电位降；Q是物质颗粒的净电荷。根据史氏定律（Stokes law）。球形分子在液体中泳动所受到的阻力（ 摩擦力）F为：F6 r 式中：r是分子半径；是介质粘度；是分子泳动速度；6是常数。当颗粒半径较大时，则常数为4，即此常数在46之间，视颗粒半径大小而定。当物质在电场中受到的力与物质在液体中受到阻力平衡时，FF与合并；EQ6 r ; =EQ/6 r 错误！未找到引用源。由于是电泳速度 （cms）E 是电场强度（Vcm）所以的单位是（cm2/ sV）。将代入上式中，则：u = v/E = Q/6r 。这就是迁移率公式。由此可见，迁移率与分子的形状、介质粘度、颗粒所带电荷有关。其与颗粒表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。然而在实际电泳中，带电颗粒的迁移率总是比理想的稀溶液中要低些。因为电泳中使用的是具有一定浓度的缓冲溶液。带电荷的生物分子在电解质缓冲溶液中将带有相反电荷的离子吸引到其周围，形成一离子扩散层。在电场中，当颗粒向相反电极移动时，离子扩散层所带有的过剩电荷向颗粒泳动的反方向移动，结果，颗粒与离子扩散层之间的静电引力使颗粒的泳动速度减慢。另外，分子颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。（2）电场强度 电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每1cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用，例如纸电泳，测量25cm长纸条两端电压降为250 V，则电场强度为250 V25 cm 10 Vcm。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳。前者的电压在 100500 V，电场强度一般是 210 Vcm，分离时间需数小时至数天；后者电压可高达5001000 V，电场强度在202000 Vcm，电泳时间短，有时仅几分钟即可，主要用于分离氨基酸、肽、核苷酸。由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置。（3）溶液的pH 溶液的pH决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。对于蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，溶液pH离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快，反之则越慢。例如，血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白pI4.0，2球蛋白pI5.06，球蛋白等pI5.1，球蛋白 pI=7.1。当在pI=8.6的缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度：白蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择一种能使各种蛋白质所带电荷量差异明显的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。（4）溶液的离子强度 溶液的离子强度是另一个重要条件。在保持足够缓冲能力前提下，离子强度要求最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离子强度选择在0.050.1molL之间。在缓冲液中离子强度可用下式计算：I0.5c Z2式中：I一溶液的离子强度；c一离子的浓度；Z一离子的价数。 例如：求0.154 molL。NaCl 溶液的离子强度。 I0.5 （0.154 I 20.154 I 2）= 0.154浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。离子强度很高时要用低电压，避免过多产热，这样又导致电泳时间延长，增加变性和区带分离困难。（5）电渗作用 在有支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中，液体对固体支持物的相对移动。例如在 pH 8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时，球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。由于纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带有较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向负阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于蛋白分子颗粒大，净电荷较小移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果球蛋白向后退。其他血清蛋白质因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此，电泳后球蛋白反而在点样位置之后，若电渗方向与样品电泳移动方向一致，则样品的表观迁移率就加快，反之则降低。所以电渗作用与电泳速度关系密切。根据支持介质的不同，可产生不同程度、不同方向的电渗流动。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamid gel electrophoresis， PAGE）是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N，N_甲叉双丙烯酰胺（N，N一Methylene bisacrylamide， Bis)，在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，他们就聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂过硫酸铵（Ap）在聚合过程中提供自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。催化剂是四甲基乙二胺（Tetramethyl ethylenediamine， TEMED）则可加快引发剂释放自由基的速度，具体反应是过硫酸铵在水溶液中形成一个过硫酸自由基，此自由基可以激活TEMED，TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子，将丙烯酰胺单体转换化成丙烯酰胺自由基，经反应，多聚物聚合成网状结构的凝胶状，其网状孔径大小由聚合条件及单体浓度决定。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟。冷却也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制 光聚合以核黄素（即VB2）作为引发剂，需要强光照射反应液和有痕量氧存在下进行。核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。光聚合时氧含量过高会抑制聚合反应。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100毫升凝胶溶液中含有的单体（Acr） 和交联剂（Bis） 总克数称为凝胶浓度，用T表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Ac r）和交联剂（Bis） 总量的百分数称为交联度，用C表示。改变凝胶浓度（T）和交联度（C），可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。一般常用7.5浓度的聚丙烯酸胺凝胶分离蛋白质，而用2.4的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见下表）。 表10-1 凝胶浓度选用物 质分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋白质10411044104110515105510520-3015-2010-155-102-5核 酸104104105105210615-205-102-2.6 聚丙烯酰胺凝胶的基本结构是丙烯酰胺形成三维网状结构。使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 电泳仪由两部分组成，即稳压稳流直流电源和缓冲液贮存系统（电泳槽）。板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，凝胶在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳（slabelectrophoresis）。板状电泳最大的优点是包括标准相对分子质量蛋白质在内的多个样品可以在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可以进行双向电泳。另外，板状电泳易散热，其结果便于照相和制干胶。板状电泳槽有垂直板和水平板电泳槽。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以采用不连续系统，这个系统的不连续性表现在以下几个方面： （1）凝胶层的不连续性：凝胶由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH的不连续性：本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.9的Tris一HCL缓冲液，浓缩胶和分离胶缓冲液均为Tris一HCl 缓冲液，但pH值分别为6.7和8.9。 （3）电位梯度的不连续性：由于pH的不连续性，在电场中形成了不连续的电位梯度。（详见后述） 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待分离的物质很好地分开。下面以本实验要分离的小麦过氧化物酶同工酶为例，分别说明这三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快，反之，分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。 （3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下。由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。在聚丙烯酰胺凝胶板中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH为8.9。HCL是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl-布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在顶层，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。 电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1-1.0%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度1和电导率S之间有如下关系：VI / S 所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被逐步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大到超过所有酶蛋白分子，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和 pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。蛋白质在PAGE时，它的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基侧链上所有正负电荷的总和。净电荷决定于环境的pH，pHpI时，蛋白质带负电荷.离等电点越远，荷电越多。尽管聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（vertical slab）型之分，但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄，易冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，而为大多数实验室采用。三、实验试剂和器材1、试剂分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液 PH8.9:取1N盐酸48ml，Tris 36.6g，用无离子水溶解后定容至100ml。电泳缓冲液:Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3:称取Tris 6g， 甘氨酸28.8g， 用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。30AcrBis贮存液：28.0g Acr，0.735g Bis， 用无离子水溶解后定容至100ml，不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。染色液：考马斯亮蓝R-250 0.05g磺基水杨酸20g 蒸馏水至100ml，过滤后置试剂瓶内保存。TEMED；0.14%过硫酸铵（新鲜配制）；40%蔗糖溶液（内含少量溴酚蓝）；7%冰乙酸溶液。2、材料人或动物血清。3、器材夹心式垂直板电泳槽，凝胶膜（135*100*1.5mm），直流稳压电源（电压300600V，电流50100mA， 移液管（1，5，10ml），烧杯（25，50，100ml），细长头的滴管，1ml注射器以及6号长针头，微量注射器（10L或者50L），培养皿（直径120mm），玻璃板（13*13cm），玻璃纸两张，日光灯一台。四、操作方法1、 安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶膜，该膜由一个U形硅胶框，长与短玻璃板及样品模槽板所组成。电泳槽由上贮槽，下贮槽和回纹状冷凝管组成，两个电极槽与凝胶模之间靠贮液槽螺丝固定，各部分按下列顺序组装：（1）装上贮槽和固定螺丝稍钉，仰放在桌面上。（2）将长短玻璃分别插到硅相框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面玻璃。（3）将已插好玻璃板的凝胶膜平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。（4）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。首先竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1琼脂，其目的是为了封住空隙，凝固后的琼脂中应该避免有气泡。然后用