药物分析-第十章抗生素类药物的分析

第十章 抗生素类药物的分析,（一）定义 抗生素（antibiotics）是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。是由细菌、真菌或其它微生物在生活过程中所产生的对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用的一类重要药物。,第十章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,一、抗生素药物的特点,（二）抗生素质量的复杂性 1、化学纯度较低。同系物多；异构体多；降解物多。 2、活性成分易发生变异。生产工艺复杂，发酵过程不易控制，易受污染。 3、产品稳定性差。分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。,第十章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,一、抗生素药物的特点,（一）鉴别试验 1官能团的显色反应 如内酰胺类的羟肟酸铁反应、氨基糖苷类的麦芽酚反应等。 2光谱法 包括紫外吸收光谱和红外吸收光谱。 3色谱法 包括高效液相色谱和薄层色谱。 4生物学法 检查抗生素的抗菌能力。,第十章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,二、抗生素药物的质量分析,（二）检查 1影响产品稳定性的指标 包括晶型、水分、pH等。 2控制有机和无机杂质的指标 包括澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等。 3与临床安全性密切相关的指标 包括异常毒性、热原、细菌或内毒素、降压物质、无菌等。 4其他指标 对多组分抗生素进行组分分析等。,第十章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,二、抗生素药物的质量分析,（三）含量测定或效价测定 1微生物检定法：以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价的一种方法。具有测定结果与临床效果一致、灵敏度高、干扰物质少等特点。但也存在操作繁琐、培养时间长、测定误差大等缺点。 2理化方法：根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学及反应而进行的。理化方法优点是准确度高、操作简便、快速，但其含量不一定代表生物效价，测定方法易受杂质干扰等问题。 3抗生素活性表示方法：抗生素的活性以效价单位表示。,第十章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,二、抗生素药物的质量分析,1-内酰胺类：主要包括青霉素类和头孢菌素类等。 2氨基糖苷类：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素等。 3四环素类：包括四环素、土霉素、金霉素等。 4氯霉素类：包括氯霉素、甲砜霉素等。 5大环内脂类：临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。 6其它：如作用于G+细菌的其它抗生素：如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等；,第十章 抗生素类药物的分析,第一节 概 述,三、抗生素的分类,（一）化学结构 青霉素类的分子结构是由母核6-氨基青霉烷酸（6-APA）和侧链RCO-两部分结合而成。孢菌素类的分子结构是由母核6-氨基头孢烷酸（7-ACA）和侧链RCO-两部分结合而成。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 1酸性 青霉素类和头孢菌素类结构中有游离的羧基，具有较强的酸性，pKa值在2.52.8之间，能与无机碱或某些有机碱成盐，如青霉素G钠、青霉素G钾等。 2旋光性 青霉素类和头孢菌素类结构中都有手性碳原子，都具有旋光性。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 1酸性 青霉素类和头孢菌素类结构中有游离的羧基，具有较强的酸性，pKa值在2.52.8之间，能与无机碱或某些有机碱成盐，如青霉素G钠、青霉素G钾等。 2旋光性 青霉素类和头孢菌素类结构中都有手性碳原子，都具有旋光性。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 3紫外吸收 青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收，但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区也有吸收。像苄青霉素。头孢菌素类分子中有共轭体系（OCNCC）在波长260nm处有最大吸收。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 4. -内酰胺环的不稳定性 干燥、纯净青霉素类抗生素稳定，其水溶液很不稳定不稳定的部分是-内酰胺环。 -内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下，可使-内酰胺环开环或发生分子重排，而失去抗菌作用，形成一系列降解产物。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,一、化学结构与性质,（一）呈色反应 1羟肟酸铁反应 青霉素和头孢菌素在碱性条件下与盐酸羟胺作用，-内酰胺环破裂生成羟肟酸，在稀酸中与高铁离子显色。 2类似肽键的反应 青霉素和头孢菌素均具有-CONH-结构，一些取代基有-氨基结构，可显茚三酮反应和双缩脲反应。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,二、鉴别试验,（一）呈色反应 3其它呈色反应 （1）与重氮苯磺酸反应 头孢哌酮结构中含有酚羟基，可与重氮苯磺酸发生偶合反应而显色。 （2）与变色酸-硫酸反应 青霉素类药物中，如阿莫西林、氨苄西林等结构中有活泼“-CH2-”经硫酸加热分解生成的甲醛与变色酸反应而呈色。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,二、鉴别试验,（二）各种盐的反应 K+、Na+的火焰反应 青霉素和头孢菌素类药物多制成钠盐或钾盐使用，可利用火焰反应进行鉴别。 （三）光谱法 1红外光谱法 内酰胺环上的羰基伸缩振动增强而向高波数方向位移，仲酰胺的氨基、羰基伸缩振动，羧基离子伸缩振动是本类药物的特征峰。 2紫外光谱法 通常利用最大吸收波长进行鉴别。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,二、鉴别试验,（一）聚合物 聚合物的定量方法： 1主成分自身对照法：同高效液相色谱法项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。 2面积归一化法：同高效液相色谱法项下规定。 3限量法：除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物质的控制。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,三、特殊杂质的检查,（一）聚合物 聚合物的定量方法： 4自身对照外标法：一般用于SephadexG-10凝胶色谱系统中-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中，除部分寡聚物外，-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，以药物自身为对照品，按外标法计算药品中高分子杂质的相对百分含量。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,三、特殊杂质的检查,（二）有关物质和异构体 通常采用色谱法（HPLC、反相TLC法等）检查-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体。 （三）杂质吸光度 药典常采用测定杂质吸光度的方法来控制本类抗生素的杂质含量。 例如：将青霉素钠（钾）配成1.80mgml-1的溶液，在波长280nm处的A0.10（控制杂质量）；在波长264nm处的A为0.800.88（检查药物量）。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,三、特殊杂质的检查,（一）碘量法 1原理 （1）水解反应（按化学计算量进行） （2）氧化-还原反应 （固定的量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定）。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,四、含量测定,（二）电位配位滴定法汞量法 青霉素本身不与汞盐反应，其水解产物青霉噻唑酸及青霉胺能与汞盐定量反应，根据消耗硝酸汞的量计算青霉素的含量。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,四、含量测定,（二）电位配位滴定法汞量法 如苯唑西林钠的含量测定：取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1molL-1氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15min，加1molL-1硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法, 用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02molL-1)缓慢滴定, ，不计第一等当点，计算第二等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02molL-1)相当于8.029mg的总苯唑西林 (按C19H19N3O5S计算)。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,四、含量测定,（二）电位配位滴定法汞量法 另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02molL-1)滴定，终点判断方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02molL-1）相当于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S计算）。 总苯唑西林的百分含量与降解物的百分含量之差值即为苯唑西林的含量。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,四、含量测定,（三）可见-紫外分光光度法 1酸水解法（铜盐法） 铜离子与青霉烯酸形成稳定的螯合物，在波长320nm处有最大吸收。 2硫醇汞盐法 青霉素在咪唑的催化下，与氯化高汞定量地反应生成青霉烯酸硫醇汞盐，在波长324345nm下有最大吸收。侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,四、含量测定,（四）HPLC法 HPLC法具有快速、高效、灵敏、专属性强、重现性好等特点，在本类药的含量中应用越来广泛。 如氨苄西林原料药含量测定：取本品约25mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀释液适量，超声处理使溶解后，再用上述稀释液稀释至刻度，摇匀，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取氨苄西林对照品25mg，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中氨苄西林（C16H19N3O4S）的含量。,第十章 抗生素类药物的分析,第二节 -内酰胺类抗生素,四、含量测定,（一）化学结构 链霉素的结构是由链霉胍和链霉糖、 N-甲基-L-葡萄糖胺结合而成的碱性苷。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,一、化学结构与性质,（一）化学结构 庆大霉素是由紫素胺和脱氧链霉胺、N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺结合而成的苷。它是由三个类似结构的C1、C2、C1a组成的混合物。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,一、化学结构与性质,C1：R1=R2=CH3 ; C2：R1=CH3, R2=H ; C1a：R1=R2=H, R3=H,（二）性质 1碱性与溶解性：由于结构中含有多个羟基和碱性基团。 2旋光性：本类药物结构中有多个氨基糖，具有旋光性。如硫酸庆大霉素的比旋度为+107。+121。 3稳定性：硫酸链霉素和硫酸庆大霉素干燥品比较稳定，硫酸链霉素水溶液在pH57.5最稳定，硫酸庆大霉素在pH212比较稳定。 4UV：链霉素max=230nm，庆大霉素无共轭双键，因此无紫外吸收。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,一、化学结构与性质,（一）茚三酮反应 本类药物具有羟基胺结构和-氨基，可与茚三酮缩合，生成蓝紫色化合物。 取庆大霉素5mg，加水1ml，0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml，吡啶0.5ml，水浴加热5min，显紫色。 （二）Molisch试验 具有五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸或硫酸作用下脱水，成糠醛（五碳）或羟甲基糠醛（六碳糖）。这些产物遇a-萘酚或蒽酮成色。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,二、鉴别试验,（三）N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应） 链霉素水解产物N-甲基葡萄糖胺在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，与二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，即生成红色化合物。 （四）麦芽酚（Maltol）反应 链霉素在碱性溶液中，链酶糖经分子重排，消除N甲基葡萄糖胺及链酶胍，生成麦牙酚，麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,二、鉴别试验,（五）坂口反应 本品水溶液，加氢氧化钠试液，水解为链酶胍，与8羟基喹啉作用，再加次溴酸钠试液，生成橙红色化合物。 （六）硫酸盐反应 本类药物多为硫酸盐，可利用硫酸盐与氯化钡试液生成白色硫酸钡沉淀进行鉴别。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,二、鉴别试验,（七） TLC法 中国药典2005版采用该法对硫酸庆大霉素进行鉴别。方法：取供试品溶液和对照品溶液各2l，分别点于同一硅胶G薄层板上，用氯仿-甲醇-氨水（1:1:1）的下层混合液为展开剂，展开后，晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液和对照品溶液所显斑点的颜色和位置应一致。 （八）光谱法 采用红外光谱法可鉴别庆大霉素。庆大霉素无紫外吸收，而链霉素可采用紫外法鉴别，max=230nm。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,二、鉴别试验,取本品适量，精密称定，加水制成含0.65mgml-1的溶液，取4ml置10ml容量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60水浴中加热15min，冷却，滤过，量取滤液10l注入高效液相色谱仪，记录色谱图。另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1、C2、C2。量取C1、C1、C2、C2的峰高，按峰面积归一化法计算：,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,三、特殊杂质检查及组分分析,规定：C1 应为2550%，C1a应为1540%，C2a +C2应为2050%。,目前各国药典均采用微生物检定法测定本类药物的效价。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,第十章 抗生素类药物的分析,第三节 氨基糖苷类抗生素,四、含量测定,（一）化学结构 四环素类抗生素具有十二氢化并四苯基本结构，属于广谱抗菌药物。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 1酸碱性与溶解度 本类抗生素结构中含有酚羟基、烯醇型羟基，显弱酸性，而二甲胺基又显弱碱性，故四环素类抗生素是两性化合物。与酸、碱均能成盐。 2旋光性 四环素类抗生素分子结构中具有不对称碳原子，有旋光性，可用于定性、定量分析。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 3紫外吸收和荧光性质 四环素类抗生素分子结构中具有共轭双键系统，在紫外区有吸收，在紫外照射下可产生荧光，它们的降解产物也具有荧光。 4与金属离子络合 与金属离子Ca2+ 、Mg2+、Fe3+、Al3+生成有色配位化合物，并在pH3 7.5产生荧光。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 5不稳定性 （1）差向异构化 弱酸性（pH2.06.0）溶液中，A环上手性C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素。 四环素和金霉素很易差向异构化，形成4-差向四环素、4-差向金霉素，他们的抗菌性极弱或完全消失。土霉素和强力霉素由于C5上的羟基和二甲胺基形成氢键，不易发生差向异构化。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,一、化学结构与性质,（二）性质 5不稳定性 （2）酸性降解反应 在酸性（pH2）时，C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水，在C6-C5a间形成双键。经重排使C环芳构化，生成脱水四环素类。 （3）碱性降解反应： 在碱性下，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环素；若强碱性下加热，可定量地转化为异四环素，后者具有强烈荧光，可荧光法测定。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,一、化学结构与性质,（一）呈色反应 四环素类抗生素遇H2SO4 、FeCl3均产生不同的颜色。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,二、鉴别试验,（二）色谱法 HPLC、 TLC法可用于四环素类抗生素鉴别，中国药典（2005版）均有收载。 （三）光谱法 IR光谱法、UV光谱法也可四环素类抗生素鉴别，中国药典（2005版）均有收载。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,二、鉴别试验,（一）有关物质 引起毒性反应的主要物质为差向异构体、脱水物、差向脱水物质，统称为有关物质。主要有4-差向四环素、脱水四环素、差向脱水四环素、盐酸金霉素等。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,三、特殊杂质的检查,（一）有关物质 中国药典2005版采用HPLC法检查盐酸四环素的有关物质：取本品适量，加0.01molL-1盐酸溶液溶解并分别制成含2.0mgml-1和0.04mgml-1溶液，作为供试品溶液和对照溶液。照含量测定项下方法试验，取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主成分峰高约为记录仪满量程的10；再取供试品溶液和对照溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4倍，供试品溶液如显杂质峰，与对照溶液主峰面积比较，计算，含4-差向四环素、盐酸金霉素、脱水四环素、差向脱水四环素分别不得过4.0、1.0、0.5、0.5,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,三、特殊杂质的检查,（二）杂质吸光度 脱水物和差向脱水物含量越高，其吸光度越大，因此，中国药典2005版还规定杂质的吸光度的限量。如盐酸四环素的杂质吸光度检查方法如下： 取本品，在2025时加0.8氢氧化钠溶液制成含10mgml-1的溶液，照分光光度法，置4cm 的吸收池中，在波长530nm处测定，自加0.8 氢氧化钠溶液起5 min时，其吸光度不得过0.12（供注射用）。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,三、特殊杂质的检查,本类抗生素的含量测定，各国药典均采用HPLC法。盐酸四环素的含量测定方法如下： 取本品约30mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.01molL-1盐酸溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取盐酸四环素对照品30mg，同法测定。按外标法以峰面积计算。,第十章 抗生素类药物的分析,第四节 四环素类抗生素,四、含量测定,1定义： 抗生素中的高分子杂质系药品中分子量大于药物本身的杂质总称。与通常在化工、生化领域中所指的高分子化合物具有完全不同的概念，其分子量一般在10005000，个别可至10000道尔顿左右，远远小于化工、生化领域中所指的高分子化合物的分子量。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,一、抗生素药物中高分子聚合物的定义、来源与分类,2来源： 抗生素中的高分子杂质按其来源通常被分为两类：外源性杂质和内源性杂质。 外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等类杂质，或抗菌药和蛋白、多肽、多糖等的结合物。外源性杂质一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。 内源性杂质系指抗菌药物的自身聚合产物，即抗菌药寡聚物和多聚物的总称。聚合物既可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时也可由使用不当产生。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,一、抗生素药物中高分子聚合物的定义、来源与分类,（一）高分子杂质的分类 1青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽 由青霉素的-内酰胺环和多肽上的伯氨基按亲核反应机理缩合而成，主要在发酵工艺中形成。高pH环境有利于缩合反应的进行；样品在贮藏过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍能和-内酰胺环反应，直至被饱和。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,二、高分子杂质的基本结构与特点,（一）高分子杂质的分类 2青霉素聚合物 青霉素的聚合反应有两种方式：一种是一分子青霉素的母核开环，形成活性位点，与另一分子青霉素母环上的活性基团聚合，侧链上的活性基团不参与反应。另一种是一分子青霉素的母核开环，形成活性位点，与侧链上的活性基团聚合。对侧链不含氨基等活泼基团的青霉素，聚合反应只按一种方式进行。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,二、高分子杂质的基本结构与特点,（一）高分子杂质的分类 3头孢菌素聚合物 头孢菌素的聚合反应亦有两种方式：一种是只发生于母核的N型聚合反应，另一种是侧链参与的L型聚合反应。对于7位侧链中不含自由氨基的头孢菌素，如头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等只能发生N型聚合反应。7位侧链中有自由氨基的头孢菌素，在酸性条件下，氨基主要以季铵盐的形式存在，一般只发生N型聚合反应。在碱性条件下，N型和L型聚合反应均可以发生。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,二、高分子杂质的基本结构与特点,（二）高分子杂质的特点 1青霉噻唑多肽类杂质结构多样。 2聚合物生成途径多样。 3以异构体存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。 4种类、数量与生产工艺密切相关。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,二、高分子杂质的基本结构与特点,高分子杂质的分析方法主要有反相液相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法（分子排阻色谱法）。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（过敏性），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此，根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法则具有明显的优势。,第十章 抗生素类药物的分析,第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查,三、高分子杂质的控制方法,