实验二 生产菌株发酵条件的优化

实验二 生产菌株发酵条件的优化实验时间：10.23 10.25实验班级： 牛物1601B实验报告人：同组成员： 刘文白 李什清1、实验目的(1) 了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出筛选所得菌株的最佳 发酵条件。(2) 掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。2、实验原理发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和 通气状况是三类最主要的发酵条件。培养基pH 般指灭菌前的pH，可通过酸 碱调节来控制，由于发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节； 通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，另外，瓶口布的厚薄也会影响到氧 气的传递，为了防止杂菌污染，瓶口布以8层纱布为好。发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中般含有较高比例 的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮 量高，还应增加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压 太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加 入碳氮源。培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所 用的培养基不同，般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。 选择碳源时常用山芋粉、麸支、玉米粉等代替淀粉。而用豆饼粉、黄豆粉等作为 氮源。此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然 原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基 的优化试验。发酵培养基中的原料多是大分子物质，微生物般不能直接吸收，必须通过 胞外酶的作用后才能被利用，所以是些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的 第1 页共11 页胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养 基中添加一些速效营养物。3、实验材料(1)菌种筛选得到的高产a定粉酶的枯草芽孢杆菌(2)培养基 种子培养基肉汤培养基：牛肉膏0.5g蛋白胨1g, NaCl 0.5g蒸馏水100mL , pH7.2 7.4 121C 灭菌 20Min。 发酵初始培养基玉米粉 3.5%,豆饼粉 2.5%, Na2HPO 4 0.8%, (NH 4)2SO 4 0.4%, NH 4Cl 0.15% 用自来水配制。(3) 淀粉酶测定试剂碘原液:称取碘化钾22g,加入少量蒸馏水溶解，加入碘11g,溶解后定容至500mL , 储存于棕色瓶中。比色用稀碘液：取碘原液2mL，加入碘化钾20g,用蒸馏水定容至500mL，储存 于棕色瓶中。2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉2g (干燥至恒重)，用少量蒸馏水混合调匀， 徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2Min后冷却，加水定容至100mL。 须当天配制。(先用冷水调匀，再加入热水)pH 6.0磷酸氢二钠书檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO 42H2O) 4.523g 柠檬酸0.807g用蒸馏水溶解并定容至100mL。标准糊精溶液：称取纯糊精0.06g悬浮于少量水中，调匀后倾入90mL沸水中， 冷却后用蒸馏水定容至100mL。加几点甲苯防腐，冰箱保存。0.5mol/L乙酸溶液。0.85%生理盐水。器材恒温水浴锅，白瓷板，分光光度计 步骤 标准曲线的制作：将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液， 分别吸取可溶性淀粉稀释液2mL加至试管中，再加入磷酸氢二卡钠柠檬酸缓冲液 1.0mL, 40C水浴保温5Min，加蒸馏水1mL加入，40C水浴保温30Min后加入 0.5mol/L乙酸溶液10mL，吸取反应液1mL ,加入稀碘液10mL ,混匀，在660nm 下测定吸光度A （用蒸馏水代替淀粉溶液同样处理后作为对照）以淀粉为横坐标, 吸光度为纵坐标，作标准曲线。样品淀粉酶测定：吸取2%可溶性淀粉溶液2mL加至试管中，再加入磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液1.0mL, 40C水浴保温5Min，用pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲 液将过滤后的发酵液（粗酶液）做适当稀释后取1mL加入，40C水浴保温30Min 后加入0.5mol/L乙酸溶液10mL，吸取反应液1mL，加入稀碘液10mL，混匀， 在660nm下测定吸光度A （用蒸馏水代替淀粉溶液同样处理后作为对照），从标 准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。淀粉酶活力以每毫升粗 酶液在40C, pH 6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。4、实验步骤要做生产菌株发酵条件的优化实验，培养基的优化和培养条件的优化都是必不 可少的。6、结果与讨论(1) 可溶性淀粉标准曲线的绘制 可溶性淀粉标准曲线绘制组别对照组12345可溶性淀粉溶液 浓度00.2%0.5%1%1.5%2%加入体积2ml2ml2ml2ml2ml2ml磷酸氢二钠诗柠 檬酸1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml40C水浴保温5min蒸馏水1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml40C水浴保温30min0.5ml/L乙酸10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml以上反应液1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml碘液10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml混匀稀释倍数无无无11660nm吸光度仪 器读数0.1830.4460.8690.4950.721660nm吸光度A10.1830.4460.8690.9901.442稀释倍数无无无11660nm吸光度仪 器读数0.1870.4380.8020.4130.759660nm吸光度A20.1870.4380.8020.8261.518稀释倍数无无无11660nm吸光度仪 器读数0.1860.4500.7700.4910.670660nm吸光度A30.1860.4500.7700.9821.340吸光度平均值0.1850.4440.8140.9331.433根据各组可溶性淀粉浓度及660nm吸光度A这两组数据进行可溶性淀粉标准曲线的绘制。2）培养条件培养基优化数据装液量初始pH优化实验组淀粉酶测定组别对照组样品1样品2样品3样品4样品5可溶性淀粉溶 液浓度02%2%2%2%2%加入体积2 ml2 ml2 ml2 ml2 ml2 ml磷酸氢二钠诗柠 檬酸1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml40C水浴保温5min酶液适当稀释1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml稀释倍数40C水浴保温30min0.5ml/L乙酸10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 mlZ以上反应液1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml碘液10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml10 ml混匀稀释倍数无1111660nm吸光度仪 器读数0.8920.5040.4560.4330.433660nm吸光度A10.8921.0080.9120.8660.866稀释倍数11111660nm吸光度仪 器读数0.4820.4310.5010.4950.363660nm吸光度A20.9640.8621.0020.9900.726稀释倍数11111660nm吸光度仪 器读数0.4600.4730.4300.4460.403660nm吸光度0.9200.9460.8600.8920.806A3吸光度平均值0.92530.9380.92470.9160.799D剩余淀粉含量(mg/ml)12.985113.174112.976212.846711.1057酶活计算28.059627.303628.095228.613235.5772备注淀粉酶酶活(mg/h l)=(20mg/ml2ml -D剩余淀粉含量乂皿1)酶液的稀释倍数/(0.5hl)剩余淀粉含量特别注意：各样品对照组由于所用酶液不同，需分别准备。数据分析：(1)由于标记问题，可能是标记过轻或用笔问题，导致分不清楚5组培养 液的初始PH值，无法进行柱状图分析。之后测从中取的粗酶液PH值和培养液 的PH值，均不大于7.(。(2) 从图表数据可以看出，酶活相差无几，仅最后一组数据上酶活相差较 大，推测是因为操作不当，使得最后一组停止反应时间相较其他组慢所导致。 因此，从数据上可以分析得出：初始PH值60-8(的调整对菌种产淀粉酶的酶 活影响不大。理论分析：(1)初始PH值不同，但数据上酶活的相差无几，推测可能是菌株在生产 淀粉酶的过程中或者酶分解淀粉的过程中，将环境中的PH值进行了调整，这么 做的原因可能是利于菌株自身的成长繁殖。也有可能是染菌导致，染菌对于酶活的影响可能大于初始PH改变的 影响，导致看不出变化。从培养液中闻出臭味即可得知。(3) 也有可能是因为操作问题，操作不当导致溶液中初始PH值发生变化， 使得酶活变化不大。可能是源于标记问题，导致瓶子上无PH标记，拿错瓶子，导致酶活 问题产生。(5)因此理论分析得知，PH值60-8的改变，可能会对酶活造成影响， 但因为操作不当或杂菌污染，影响不明显；也有可能是因为初始PH值对酶活确 实无明显影响。3)实验照片KTr njriH丄IllrlI不I.叫I0我。班L10 ml桶忙J充一噪）t廈平均嚴一gilmn n.住；=迺A2划血IE血冷也肚fWCnm吸光度枝aitjfc妙nm皈先度A）D f 蚩弟史巴_ w.逹 細hrtt騒光度也娜遽樂_AL上吐去级硕耳 云卅卫加匕1逼21 =niZISLXX2CQftjSmlZL._劈理丽I H-1 . r_ _繍茫fe軸如h二匚| _， - -i - j啤出L丄 |_卫矿一逆缈-_步備ml飞眾裔jfi 点Ft二I I 一 I训訥人雀(11I7、问答题(1)如果不用正交实验，四因素三水平的实验总共需要做几组？ 答：4 的三次方，64 种。(2)如果用合适的缓冲液来调节pH,进行培养基pH对淀粉酶产生的影响试验, 是否使结果更可靠？ 答：会使结果更可靠。为了保证培养基 PH 单一量优化,其他量最好保持相同 缓冲液可以保证反应PH值相同，因此会使结果不受反应PH值不同带来的影响。 因此选用合适的缓冲液调节 PH 值,会使结果更可靠。