艾滋病、梅毒实验室检测

艾滋病、梅毒实验室检测艾滋病、梅毒实验室检测方法及生物安全方法及生物安全高金亮高金亮 博士博士 分子生物学主任技师分子生物学主任技师鄂尔多斯市疾病预防控制中心鄂尔多斯市疾病预防控制中心 _ _年年_月月_日日 艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficency syndrome,AIDS)。是人类因为感染是人类因为感染人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）后导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤，严）后导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤，严重者可导致死亡的综合征。目前，艾滋病已成为严重威胁重者可导致死亡的综合征。目前，艾滋病已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题。世界人民健康的公共卫生问题。艾滋病艾滋病艾滋病的发现艾滋病的发现 美国美国19811981年首先发现年首先发现5 5名同性恋中患卡氏肺孢子虫肺炎，数月后又在另外数例同性恋中名同性恋中患卡氏肺孢子虫肺炎，数月后又在另外数例同性恋中发现卡波济氏肉瘤，相同的情况也出现在静脉吸毒人群中。均有免疫功能减退，主要是发现卡波济氏肉瘤，相同的情况也出现在静脉吸毒人群中。均有免疫功能减退，主要是CD4+TCD4+T细胞的数减少。称为获得性免疫缺陷综合症。同年细胞的数减少。称为获得性免疫缺陷综合症。同年_月月_日美国日美国CDCCDC最先向全世界报道最先向全世界报道AIDSAIDS。1983 1983年，美国马里兰大学年，美国马里兰大学Robert GalloRobert Gallo等从艾滋病病人体内分离到一种与人类等从艾滋病病人体内分离到一种与人类T T淋巴细胞淋巴细胞白血病病毒白血病病毒(HTLV)(HTLV)非常相似的病毒，遂将该新发现的病毒命名为人类非常相似的病毒，遂将该新发现的病毒命名为人类T T淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病IIIIII型病型病毒（毒（HTLV-IIIHTLV-III）（）（Science 220(4599):865867Science 220(4599):865867）。与此同时，法国巴斯德研究所的）。与此同时，法国巴斯德研究所的 Luc Luc Montagnier Montagnier 等从一颈部淋巴结肿大、体质虚弱的艾滋病患者体内分离到一种病毒，该病毒的等从一颈部淋巴结肿大、体质虚弱的艾滋病患者体内分离到一种病毒，该病毒的核心蛋白与核心蛋白与HTLV-I HTLV-I 的免疫学特性不同，遂将该病毒命名为淋巴腺病相关病毒的免疫学特性不同，遂将该病毒命名为淋巴腺病相关病毒(LAV)(LAV)（Science Science 220(4599):868871220(4599):868871）。后经证实这两种病毒为同一种病毒，于）。后经证实这两种病毒为同一种病毒，于19861986年将该病毒更名为年将该病毒更名为HIVHIV。同年在非洲发现异性间传播并发现同年在非洲发现异性间传播并发现HIV-2HIV-2。WHO WHO报告报告_年全球约有年全球约有34003400万人感染万人感染HIVHIV，新感染，新感染270270万，全年死亡万，全年死亡180180万人。每天有超万人。每天有超过过70007000人新发感染。世界各地区均有流行，但人新发感染。世界各地区均有流行，但97%97%以上在中、低收入国家，尤以非洲为重。以上在中、低收入国家，尤以非洲为重。在_年年底各国青壮年（15-49岁）艾滋病的流行程度估计艾滋病流行状况_年底各国艾滋病患者及HIV携带者人数估计1、发现：1985年，一位美籍阿根廷青年以旅游者的身份进入中国，不久便因发烧、肺部感染住进北京协和医院，因该患者对各种抗感染类药物均没有作用，随后进行的血清检测发现其HIV呈阳性。2、流行现状：中国CDC估计，截止至_年底，我国存活HIV携带者及艾滋病患者约78万人，全年新发感染者4.8万人，死亡2.8万人。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市，目前我国面临艾滋病发病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散。_年疫情估计结果显示，云南、广西、河南、四川、新疆、广东等6省HIV感染者超过5万人，占全国估计总数的61.8%；15万人的省份有9个；5千人以下的省份有8个，占全国估计总数的2.3%。累计报告艾滋病病毒感染者和病人数排在后7位的省份是西藏、青海、宁夏、内蒙、天津、甘肃、海南，报告人数不到全国报告总数的1%。中国AIDS流行情况病原学病原学1 1、病原体、病原体 AIDS的病原体是人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV属于反（逆）转录病毒科，慢病毒属人类免疫缺陷病毒组。2 2、病毒形态结构、病毒形态结构vHIV呈球形或椭球形，直径100-120nmv电镜下成熟的HIV-1呈现一致密的圆柱状核心和一个病毒包膜。v外层为类脂质包膜，膜上为突起插入，突起由糖蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）以共价键连接而成。v病毒核心由病毒RNA、逆转录酶、整合酶和蛋白酶，有核心蛋白p24、P6、P9包裹vHIV的RNA为两条相同拷贝（完全同源）的正股RNA链。HIV的形态的形态v HIVHIV的逆转录酶缺乏的逆转录酶缺乏3 35 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 ，无，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。3、HIV的基因结构及分型HIV可分为HIV-和HIV-两型。HIV-1全长9181bp,HIV-2全长10359bp.（1）基因组成：）基因组成：:LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-LTR.:LTR-gag-pol-vif-vpx-vpr-tat-rev-env-nef-LTR.(2)两者的主要区别：两者的主要区别：型含有vpu，而型含vpx。vpr和nef与其他基因的关系也不同：A HIV-的vpr与vif相互重叠，而nef与env不重叠；B HIV-的vpr与vif不重叠，而nef与env相互重叠。（3）结构基因表达产物）结构基因表达产物 HIV-HIV-包膜蛋白基因包膜蛋白基因env：gp160 gp120 gp41 gp140 gp105 gp36 群抗原基因群抗原基因gag：p55 p24 p18 p56 p26 p16多聚酶基因多聚酶基因pol：p65 p51 p31 p68 p53 p34 HIV-1HIV-1通过通过gp120gp120与靶细胞表面与靶细胞表面CD4CD4分子分子和趋化因子受体结合和趋化因子受体结合HIV辅助受体辅助受体gp120与与CD4特异受体结合细胞内两条病毒特异受体结合细胞内两条病毒RNA链逆转录酶链逆转录酶逆转录成单链逆转录成单链DNADNA聚合酶复制。一部分装配成聚合酶复制。一部分装配成HIV,以芽生方式释出以芽生方式释出,再感染其再感染其它细胞。一部分与宿主的它细胞。一部分与宿主的DNA整合，成为潜伏状态的前病毒。整合，成为潜伏状态的前病毒。艾滋病的传播途径HIV主要存在于HIV感染者/艾滋病患者的体液中，包括血液、精液、阴道分泌液、乳汁、伤口渗出液等。任何能够引起体液交换的行为，都有传播HIV的可能。三种传播途径三种传播途径1、性传播：通过异性或同性性行为传播。2、血液传播：a.通过共用注射器或针头注射毒品；HIV的血液或血制品；c.使用未经消毒或消毒不严格的医疗器械(如针头、针灸针、牙科和美容器械等)d.通过共用剃须刀(刮脸)及牙刷等传播；3、母婴传播：通过胎盘、产道和哺乳传播。vHIV对环境中理化学因素对环境中理化学因素抵抗力抵抗力均较弱，比均较弱，比HBV的抵抗力低得多。的抵抗力低得多。v对对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。vHIV对热很敏感，对低温耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活病毒，对热很敏感，对低温耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活病毒，在低温条件下保存病毒。在低温条件下保存病毒。v在室温（在室温（2227）液体环境下）液体环境下HIV可存活可存活15天以上；经天以上；经56处理处理30 min可使可使HIV在体外对人的在体外对人的T淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的中的HIV；经过；经过60 3小时或小时或80 30min作用后不能检出感染性病毒。作用后不能检出感染性病毒。vHIV耐碱不耐酸耐碱不耐酸v室温中室温中0.5%次氯酸钠或次氯酸钠或75%酒精只需酒精只需1min即不能检出即不能检出RT酶活性；酶活性；v0.2%次氯酸钠、次氯酸钠、0.1%家用漂白粉、家用漂白粉、0.1%戊二醛等戊二醛等5min即可灭活即可灭活；v30%酒精溶液酒精溶液5min、20%酒精溶液酒精溶液10min可灭活可灭活HIV。v对紫外线不敏感，离开人体可存活数小时至数天。对紫外线不敏感，离开人体可存活数小时至数天。病毒生物学特性病毒生物学特性实验室检测实验室检测艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS298-2008全国艾滋病检测技术规范（全国艾滋病检测技术规范（_年修订版）年修订版）全国艾滋病检测工作管理办法卫疾控发全国艾滋病检测工作管理办法卫疾控发2006218号号依据依据检测目的检测目的v1.临床诊断临床诊断v2.安全输血安全输血v3.流行病学调查、高危人群监测流行病学调查、高危人群监测v4.自愿咨询检测自愿咨询检测VCTv5.抗病毒治疗后效果检测抗病毒治疗后效果检测v6.抗病毒治疗耐药性检测抗病毒治疗耐药性检测v7.免疫功能测定免疫功能测定艾滋病诊断的特殊性艾滋病诊断的特殊性 v高度依赖实验室诊断高度依赖实验室诊断vHIV检测的严肃性：检测的严肃性：保证输血、器官移植的安全保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题错误结果将导致严重的法律问题v结果严格保密结果严格保密HIV检测实验室及管理要求检测实验室及管理要求v检测工作必须在经批准的艾滋病实验室内进行。未设置艾滋检测工作必须在经批准的艾滋病实验室内进行。未设置艾滋病实验室的机构或单位及未经备案或批准的艾滋病实验室不病实验室的机构或单位及未经备案或批准的艾滋病实验室不得开展相关的艾滋病检测工作。得开展相关的艾滋病检测工作。v国家对艾滋病检测实验室实行分类管理，按照实验室的职能、国家对艾滋病检测实验室实行分类管理，按照实验室的职能、开展检测工作的性质及范围共分三类实验室，分别是开展检测工作的性质及范围共分三类实验室，分别是艾滋病艾滋病参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验室室（包括：艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾（包括：艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点）滋病检测点）。v必须立即开展或已经开展艾滋病检测工作而又暂时不具备艾必须立即开展或已经开展艾滋病检测工作而又暂时不具备艾滋病筛查实验室设置条件的单位，作为一种过渡，可以暂时滋病筛查实验室设置条件的单位，作为一种过渡，可以暂时设立设立“艾滋病检测点艾滋病检测点”。“艾滋病检测点艾滋病检测点”也必须达到也必须达到安全安全防护防护的基本要求，并经省（自治区）卫生行政部门批准和备的基本要求，并经省（自治区）卫生行政部门批准和备案。案。v艾滋病实验室的仪器设备应能满足安全防护要求。使用国家艾滋病实验室的仪器设备应能满足安全防护要求。使用国家规定需要强检的仪器设备，必须由同级计量认证部门定期检规定需要强检的仪器设备，必须由同级计量认证部门定期检定，非国家强检的仪器设备应定期维护和校准。定，非国家强检的仪器设备应定期维护和校准。v艾滋病检测工作中所使用的检测试剂，必须使用经国家食品艾滋病检测工作中所使用的检测试剂，必须使用经国家食品药品监督管理局注册、中国药品生物制品检定所药品监督管理局注册、中国药品生物制品检定所“批批检批批检”合格，且在有效期内的试剂；推荐使用经临床质量评估敏感合格，且在有效期内的试剂；推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂；严格按试剂盒操作说明书操作。性和特异性高的试剂；严格按试剂盒操作说明书操作。v从业人员需经过培训，持证上岗。从业人员需经过培训，持证上岗。1.艾滋病实验室应对所使用的艾滋病检测试剂实施定艾滋病实验室应对所使用的艾滋病检测试剂实施定期监测，以保证检测试剂的稳定性。期监测，以保证检测试剂的稳定性。2.艾滋病检测过程中，应严格按试剂操作说明书操艾滋病检测过程中，应严格按试剂操作说明书操作，作好质量控制。遇到疑难情况应报上一级实验室帮作，作好质量控制。遇到疑难情况应报上一级实验室帮助解决。助解决。3.按照全国艾滋病检测技术规范要求，作好实按照全国艾滋病检测技术规范要求，作好实验记录、档案管理和保存工作。验记录、档案管理和保存工作。4.每年参加省疾控中心艾滋病确认中心实验室或其每年参加省疾控中心艾滋病确认中心实验室或其委托的初筛中心实验室对各艾滋病实验室进行的室间质委托的初筛中心实验室对各艾滋病实验室进行的室间质量考评。量考评。质量控制和室间质量考评质量控制和室间质量考评BSL 实验室设计和建造的要求：应有专门放置生物废弃物容器的台(架)。应设置实施各种消毒方法的设施，如高压灭菌锅、化学消毒装置等对废弃物进行处理。应设置洗眼装置。实验室门宜带锁、可自动关闭。实验室出口应有发光指示标志。1.生物安全柜HIV抗体检测（筛查和确证）、抗原检测、相关免疫学检测、HIV核酸提取和检测、HIV阳性样品的保存均应在生物安全级实验室(BSL)内进行。凡涉及活病毒的研究工作(如病毒分离培养、浓缩、中和试验、细胞培养、病毒保存)均应在生物安全级实验室(BSL)内进行。HIV相关检测的生物安全级别相关检测的生物安全级别 初筛实验室设计和建造的要求：有专用实验室（至少专用检测台），应划分清洁区和污染区，并有明显标记，有充足的操作空间。实验室墙面、地面、台面材料应来耐酸、碱、易清洁消毒、不渗漏液体；室内应有防蚊、防蝇、防鼠等设备 检验台上应装置紫外灯。备有消毒药品、消毒器材和消毒设备。有感应流水装置，备有冲眼睛水，足够的一次性手套、口罩、隔离服和防护眼镜。(6)实验室应装置恒温设备,室温为2025。HIV感染后的血清学改变感染后的血清学改变HIVHIV感染的实验室检测方法感染的实验室检测方法常用常用HIVHIV病原学检测方法病原学检测方法:1.1.核酸检测核酸检测（cDNAcDNA测定测定-PCR-PCR、RNA RNA测定测定-病毒载量病毒载量）2.2.病毒培养分离病毒培养分离 3.3.P24P24抗原检测抗原检测常用常用HIVHIV抗体检测方法抗体检测方法:初筛：初筛：1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 ELISAELISA：第三代、第四代第三代、第四代 2.2.快速检测快速检测 RT RT：金标、硒标金标、硒标 3.3.简单法简单法 PA:PA:明胶颗粒凝集明胶颗粒凝集 确证：免疫印迹法确证：免疫印迹法 WB:WB:（Western BlotWestern Blot）其他相关检测方法其他相关检测方法:免疫功能测定：免疫功能测定：CD4/CD8CD4/CD8检测检测 各种分子生物学技术各种分子生物学技术（一）（一）HIV核酸检测核酸检测v通常使用通常使用PCR或或RT-PCR技术，用于技术，用于HIV感染的辅助诊断。感染的辅助诊断。核酸检测特点核酸检测特点用于检测不能培养和分离的病毒（如用于检测不能培养和分离的病毒（如HBV、HCV、HIV等）；等）；仅需少量标本或标本中仅含少量病毒；仅需少量标本或标本中仅含少量病毒；能在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前做出诊断；能在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前做出诊断；可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测；可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测；可对病毒进行基因分型，比血清分型更有价值；可对病毒进行基因分型，比血清分型更有价值；对病毒的耐药基因进行检测，可预测或发现病毒的耐药性；对病毒的耐药基因进行检测，可预测或发现病毒的耐药性；可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断；可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断；灵敏度高（可达灵敏度高（可达ng甚至甚至fg水平，理论上能检出单个病毒基因），水平，理论上能检出单个病毒基因），特异性好、快速、简捷。特异性好、快速、简捷。核酸检测主要应用核酸检测主要应用 1）早期诊断围产期早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断：感染的辅助诊断：宫内感染（检测定义）：宫内感染（检测定义）：新生儿出生新生儿出生48小时内，检测到小时内，检测到病毒核酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。病毒核酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。对围产期感染儿童在对围产期感染儿童在1_月龄前的早期诊断，目前以月龄前的早期诊断，目前以2次次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸次不同时间的样本核酸检测均为阳性提示为检测均为阳性提示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时感染，均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测，当个月时做抗体检测，当18个月个月HIV抗体确证阳性方可诊断抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。感染。核酸检测主要应用核酸检测主要应用v2）对）对18个月婴儿个月婴儿HIV抗体抗体WB试验的不确定（或可疑）结试验的不确定（或可疑）结果进一步做辅助诊断；果进一步做辅助诊断；v3）在）在HIV抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断急性原发抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断急性原发感染；感染；v4）HIV亚型分析；确定人群中亚型分析；确定人群中HIV的变异；的变异；v5）监测临床抗病毒药物治疗效果；）监测临床抗病毒药物治疗效果；v6）检测病毒的耐药性突变。）检测病毒的耐药性突变。（二）（二）HIV病毒分离培养病毒分离培养v将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测定培养液培养后测定培养液HIV p24抗原抗原/RT，从而判断病人的淋，从而判断病人的淋巴细胞是否受到巴细胞是否受到HIV感染。感染。v细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或性。但其敏感性不如血清学或PCR。v必须在必须在P3级生物安全实验室进行。级生物安全实验室进行。HIV病毒分离培养的应用病毒分离培养的应用v1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB不不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。对法律感染者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。v2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特性等研毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特性等研究。究。v3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（TCID50）和半数抑制药物浓度（和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒药物测定。或消）用于抗病毒药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。毒杀菌药品的效果评价。v 本法一般不用于常规诊断。本法一般不用于常规诊断。（三）（三）HIV p24抗原测定及适用范围抗原测定及适用范围v是一种血清学夹心法是一种血清学夹心法EIA。v（1）HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。抗体不确定或窗口期的辅助诊断。v（2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。v（3）第四代）第四代HIV抗原抗原/抗体抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，试剂检测呈阳性反应，但但HIV-1抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。v（4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。）监测病程进展和抗病毒治疗效果。HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释：抗原检测结果报告和解释：v（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。过中和试验确认。v（2）HIV-1 P24抗原阳性仅作为抗原阳性仅作为HIV感感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。染的辅助诊断依据，不能据此确诊。v（3）HIV-1P24抗原阴性结果只表示在抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除本试验中无反应，不能排除HIV感染。感染。（四）（四）HIV抗体检测抗体检测v检测抗检测抗-HIV抗体是抗体是HIV/AIDS诊断的一项重要指标，抗诊断的一项重要指标，抗-HIV抗抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，必须经初筛、复检体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，必须经初筛、复检试验和确认实验三个步骤。试验和确认实验三个步骤。v初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、明胶颗粒）、明胶颗粒凝集试验（凝集试验（PA）、快速免疫（层析或渗滤）试验（）、快速免疫（层析或渗滤）试验（RT）。）。v确认试验主要用免疫印迹试验（确认试验主要用免疫印迹试验（WB）。）。快速检测（快速检测（RTRT）肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。样本要求样本要求。v1 1、将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。、将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。v2 2、将所需数量的测试卡从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，、将所需数量的测试卡从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上。平置于台面上。v3 3、在测试卡加样处缓慢滴加、在测试卡加样处缓慢滴加10I10I待测血清待测血清/血浆或血浆或20I20I全血标本，然后滴全血标本，然后滴加加3 3滴样品稀释液。滴样品稀释液。v4 4、5-205-20分钟内判断结果，超过分钟内判断结果，超过2020分钟观察无效。操作温度需在分钟观察无效。操作温度需在15-3015-30注意事项注意事项 固相固相血清标本血清标本酶标记物酶标记物YYYYYYYYYYYYYYYY各代检测方法示意图第一、二代第一、二代第三代第三代第四代第四代4th 代代3rd 代代=1st-2nd 代代HIV 抗原抗原IgM 抗体抗体IgG 抗体抗体检测线检测线=窗口期窗口期HIV感染窗口期实例一、人类免疫缺陷病毒抗体检测实例一、人类免疫缺陷病毒抗体检测方法：方法：酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验用酶标记抗原或抗体检测用酶标记抗原或抗体检测体体液（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。液（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。用已知抗原包被微孔板，检测未知抗体用已知抗原包被微孔板，检测未知抗体洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤待测抗体待测抗体酶标抗抗体酶标抗抗体E固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标抗原酶标抗原底物底物EE双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体用已知抗体包被微孔板，检测未知抗原用已知抗体包被微孔板，检测未知抗原洗洗涤涤洗洗涤涤洗洗涤涤待测抗原待测抗原洗涤洗涤洗涤洗涤待测抗原待测抗原酶标抗原酶标抗原具体操作：具体操作：人类免疫缺陷病毒抗体检测人类免疫缺陷病毒抗体检测(试剂盒购自珠海试剂盒购自珠海丽珠公司）丽珠公司）实验步骤（生物安全柜内！）实验步骤（生物安全柜内！）v1.用去离子水或蒸馏水20倍稀释浓缩洗涤液。v2.将所需数量的条板固定于支架，按顺序编号（同时填表格），设空白对照1孔，阳性对照2孔，阴性对照3孔和样品孔若干。空白孔不加任何液体，阴性，阳性对照孔分别加入50l（2滴）阴性和阳性对照，在样品孔中加入50l待测样品，用不干胶封板，轻轻拍匀。v3.置37水浴温育60分钟。v4置洗扳机用洗涤液充分洗涤6遍，扣干（注：洗涤时各孔要加满洗液，勿使孔间交叉污染）。v5.每孔加入50l酶标记物（空白孔除外），轻拍混匀，封板。v6.置37水浴温浴30分钟。v7.置洗扳机用洗涤液充分洗涤6遍，扣干（注：洗涤时各孔要加满洗液，勿使孔间交叉污染）。v8.每孔加入50l底物缓冲液和50l底物液，轻拍混匀置37温育30分钟。v9.每孔加入50l终止液终止显色反应。v10.用酶标仪单波长450nm（需设置空白对照，并以空白对照孔调零）或双波长450nm/630nm测定各孔A值。结果判定结果判定1.临界值（Cutoff）阴性对照平均A值2.样品的A值Cut off值者为HIV抗体反应阳性。3.样品的A值Cut off值者为HIV抗体反应阴性。4.正常时，阴性对照A值应，阳性对照A值应，阴性对照A值若小于以计算。5.若阳性对照A值孔间之差大于30%，应重复实验。6.初次实验阳性者应重新取样进行双孔复试，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认实验。注意事项注意事项本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。整个HIV检测必须符合全国艾滋病检测工作规范，严格防止交叉感染。操作时必须戴手套，穿工作服，严格健全和执行消毒隔离制度。HIV-1/HIV-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。样品，酶结合物溶液等应用加液器加注，并经常校对其准确性。洗涤时各孔均应加满洗液，防止孔口有游离酶不能洗净。所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。微孔板条从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干净方可使用；未用完者需放入有干燥剂的密封袋中保存。用于检测的样品应保持新鲜。剩余样品及废弃物应经121高压蒸汽灭菌30分钟，或用次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。1.不同批号的试剂组分不可混用。筛查结果报告筛查结果报告vHIVHIV抗体初筛试验用抗体初筛试验用附表附表1 1进行报告，阴性反应报告进行报告，阴性反应报告为为“HIVHIV抗体阴性（抗体阴性（-）”；阳性反应报告为；阳性反应报告为“HIVHIV抗体待复检抗体待复检”。vHIVHIV抗体复检试验用抗体复检试验用附表附表2 2进行报告，进行报告，两次检测均阳两次检测均阳性或一阴一阳报告为性或一阴一阳报告为“HIV抗体待确证抗体待确证”；两次检两次检测均阴性报告为测均阴性报告为“HIV抗体阴性（抗体阴性（-）”。HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。疑似阳性标本的送检疑似阳性标本的送检A A类包装类包装 主容器主容器A A类包装类包装 次级容器次级容器A A类包装类包装 外包装外包装1、免疫印迹式验（、免疫印迹式验（WB）：）：WB是将是将HIV病毒蛋白用病毒蛋白用SDS-PAGE电泳，把分子量电泳，把分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条装，同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条装，每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。病毒抗原。待检血清样品待检血清样品1：100稀释，加到放置硝酸纤维膜的槽稀释，加到放置硝酸纤维膜的槽内，恒温震荡，充分接触反应。血清中抗内，恒温震荡，充分接触反应。血清中抗-HIV抗体，与膜抗体，与膜条上的抗原带相结合。加入抗人条上的抗原带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，酶结合物和底物后，即可使抗原即可使抗原-抗体结合带呈现紫褐色。根据出现条带情况抗体结合带呈现紫褐色。根据出现条带情况判定结果。判定结果。HIV抗体确认试验抗体确认试验a 强阳性对照（强阳性对照（HIV-1和和HIV-2）b弱阳性对照（弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照阴性对照d典型的典型的HIV-2血清阳性反应血清阳性反应线性免疫印迹示例线性免疫印迹示例检测过程中要求要求 医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则(试行)(_.5.31)：第八条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，应当立即实施以下局部处理措施：1、用肥皂液和流动水清洗污染的皮肤，用生理盐水冲洗粘膜。2、如有伤口，应当在伤口旁轻轻挤压尽可能挤出损伤处的血液，再用肥皂液和流动水进行冲洗；3、受伤部位的伤口冲洗后，应当用消毒液（如75酒精、2000mg/L次氯酸钠、0.20.5%过氧乙酸、0.5%碘伏）进行消毒，并包扎伤口，被暴露的粘膜，应当反复用生理盐水冲洗干净。第九条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，医疗机构应当对其暴露的级别和暴露源的病毒量水平进行评估和确定 一、发生以下情形，确定为一级暴露：1、暴露源为体液、血液或者含有体液、血液的医疗器械、物品。2 暴露类型为暴露源沾污了有损伤的皮肤或者粘膜，暴露量小且暴露时间较短。二、发生以下情形，确定为二级暴露：1、暴露源为体液、血液或者含有体液、血液的医疗器械、物品。2、暴露类型为暴露源沾污了有损伤的皮肤或者粘膜，暴露量大且暴露时间较长；或者暴露类型为暴露源刺伤或者割伤皮肤，但损伤程度较轻，为表皮擦伤或者针刺伤。三、发生以下情形，确定为三级暴露：1、暴露源为体液、血液或者含有体液、血液的医疗器械、物品。2、暴露类型为暴露源刺伤或者割伤皮肤，但损伤程度较重，为深部伤口或者割伤物有明显可见的血液。第十条第十条 艾滋病病毒职业暴露级别分为三级第十一条第十一条暴露源的病毒载量水平分为：轻度、重度和暴露源不明三种类型。暴露源不明：不能确定暴露源是否为HIV病毒阳性者轻度：经检验，暴露源为HIV病毒阳性，但滴度低，艾滋病病毒感染者无临床症状、CD4计数正常者。重度：经检验，暴露源为HIV病毒阳性，但滴度高，艾滋病病毒感染者有临床症状、CD4计数低者。第十二条：第十二条：医疗卫生机构应当根据暴露级别和暴露源病毒载量水平对发生艾滋病病毒职业暴露的医务人员实施预防性用药方案。第十三条第十三条预防性用药方案分为基本用药程序和强化用药程序。基本用药程序：为两种逆转录酶制剂，使用常规剂量，连续使用28天。强化用药程序：是在基本用药程序的基础上，同时增加一种蛋白酶抑制剂，使用常规治疗剂量，连续使用28天。预防性用药应当在发生艾滋病病毒职业暴露后尽早开始，最好在4h内实施，最迟不得超过24h；即使超过24h，也应当实施预防性用药。（早、有）发生一级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度时，可以不使用预防性用药；（一级轻度不用药）发生一级暴露且暴露源的病毒载量水平为重度或者发生二级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度时，使用基本用药程序。（一级重度或二级轻度用基本）发生二级暴露且暴露源的病毒载量水平为重度或者发生三级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度或者重度时，使用强化用药程序。（二级重度或三级用强化）暴露源的病毒载量水平不明时，可以使用基本用药程序。第十四条第十四条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，医疗卫生机构应当给予随访和咨询。随访和咨询的内容包括：在暴露后的第4周、第8周、第12周及6个月时对艾滋病病毒抗体进行检测，对服用药物的毒性进行监控和处理，观察和记录艾滋病病毒感染的早期症状等。RPRRPR试验试验v梅毒患者血清中存在着能与VDRL抗原发生凝集反应的反应素，利用这一原理，将VDRL抗原吸附于活性炭颗粒表面，当待测血清中存在反应素时，即与其发生凝集反应，出现肉眼可见的黑色凝块。v用白色的硬纸片替代玻片v血清不需要灭活v不需要显微镜观测结果v可作定量试验（一）梅毒螺旋体快速血浆反应素环状卡片试验（一）梅毒螺旋体快速血浆反应素环状卡片试验 TRUSTn其原理和成分与RPR试验相同n用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒 n其余的特点均与RPR相同实例二、梅毒螺旋体诊断试验操作要点试验操作要点定性试验分别吸取50微升梅毒阳性对照和阴性对照均匀铺加在纸卡的两个圆圈中。另吸取50微升待检血清均匀铺加在纸卡的另一圆圈中。用盒中的专用针头，滴管吸取RPR试剂，分别垂直滴加1滴于上述血清中。1.用RPR旋转仪水平转动纸卡8分钟，100转/分钟，然后3分钟内在光线充足处判定结果。定量试验n定性实验呈弱阳性或阳性必须做定量实验才能了解患者血清中的抗体滴度，具体方法如下：将待检血清用生理盐水作倍比稀释（原血清，1：2，1：4，1：8，1：16，1：32），然后对每个稀释度的血清按定性实验方法进行测定并判定结果。RPRTRUSTVDRL结果判断结果判断滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数。+明胶颗粒梅毒螺旋体+致敏明胶颗粒致敏明胶颗粒梅毒特异性抗体凝集（二）梅毒确认试验（二）梅毒确认试验TPPATPPA1、试验原理、试验原理TPPA试验用梅毒Treponema Pallidum（Nichols株）的精制菌体成分致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。可用于检测血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体，并可用来测定抗体效价。明胶粒子为洋红色，在操作部步上也较为方便，出结果较快。TPPATPPA试验检测流程试验检测流程试验前期准备v微量振荡仪v试剂检查v25l移液器、吸头v记号笔、废物缸v有盖湿盒v工作服v一次性手套、口罩、帽子v生物安全柜TPPATPPA试验检测流程试验检测流程v使用前将试剂盒从冰箱中取出，室温放置30分钟。v在96孔U型板上编上相应的待检样本的编号。v按标签标明量（0.6ml)向每瓶冻干致敏粒子（C液）和未致敏粒子（D液）各加入溶解液（A液）复溶，置室温不得少于30分钟。方法方法1 1v每份标本做4孔，加血清稀释液（B液）至U型反应板，第1孔100l，第24孔各25 l。v用移液器取血清25l至第1孔，反复混匀后取25 l至第2孔，连续倍比稀释至第4孔，最后1孔混匀后弃去25l。v第3孔加未致敏粒子D液25 l，第4孔加致敏粒子C液25 l v将微量反应板置震荡器震荡30秒。v置微量反应板于有盖湿盒内，室温（15-30）静置2小时后，观察结果。方法方法2 2方法1判定为阳性的样品，用方法2进行复检对照试验能够确认每例样品未致敏粒子的反应（最终稀释倍数1：40）均是（-）。能够确认每次检查中血清稀释液和致敏粒子以及未致敏粒子的反应均是（-）（介质对照）。1.每个试剂盒中的阳性对照血清都要与样品用相同的测定方法进行试验。阳性对照血清调制成抗体效价为1：320（最终稀释倍数）结果报告:v观察加未致敏粒子D液的第3孔，不出现凝集为有效试验。v阳性：第3孔不出现凝集，第4孔出现1+4+凝集反应。v阴性：第3、4孔均不产生凝集反应。反应图象判定粒子呈纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的图形（）粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的图形（）粒子环明显变大，其外周；边缘不均匀且杂乱地凝固在周围（）产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延伸（）吸收操作吸收操作 对于未致敏粒子和致敏粒子均显示（）以上凝集的样品，要按照下列顺序在完成吸收操作的基础上进行试验。取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子至小试管中。加入样品50l混合，于室温（15-30）下放置20分钟以上。离心分离（2000r/min）5分钟，然后分取上清夜【吸收完毕后的稀释品（1：20）】50l至反应板第3孔中，特别注意不要混入粒子。从第4孔以后，要预先滴入25l血清稀释液，从第3孔至最后1孔用微量加样器或微量移液管以2n的方式进行稀释。1.以后就与“测定操作”2-3同样的操作进行判断。通常情况可以用上述的吸收操作完全吸收，但如果吸收不尽时，请使用其它的检查方法。Thanks!