《组织切片技术》PPT课件

组织学切片技术,大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，另外由于细胞内各个结构的折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。 组织学技术是教学和科研中常用的方法。组织在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后，用切片机切成较薄的切片，再经不同的染色就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，组织切片也便于保存。 组织学标本的制作技术是组织学，胚胎学，生物学、病理学、肿瘤学、法医学及临床诊断学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要手段。,组织学技术包括： 组织学制片技术 组织化学技术 荧光组化及免疫组化技术 各种特殊显微技术 电镜组织学技术 组织培养技术等,一、概 述,二、组织学制片技术的分类,组织学制片技术有很多不同的制片方法，一般可分为切片法与非切片法两大类： 切片法：石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等。 非切片法：铺片、涂片、压片、磨片、整装片等。,即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可能观察清楚的不足，因此是组织标本制备中常用的手段。,1、非切片法,1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。 1.2 铺片法 主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察组织，用尖镊子迅速将组织平铺在载玻片上。如: 疏松结缔组织铺片标本的制备。,1.3 压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如骨骼肌运动终版的制备。 1.4 磨片(Ground section) 用于很坚硬的组织，如骨和牙。,血涂片,骨磨片,疏松结缔组织铺片,铺片,上皮组织铺片,切片法是必须依靠切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要脱蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。,2、切片法,石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。现以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备方法。,组织学制片步骤：,取材 固定 冲洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 修块 切片 贴片 烤片 染色 封片 观察结果,根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。 所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。 一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，动物组织取材要稍大，植物组织取材稍小。,2.1 取材,手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。 手术切除标本的取材： 病灶在组织中的分布常存在不均一性，取材要有代表性，取材部位要兼顾：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。 各种组织的活检取材： 活检取材体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。,2.1.1 人体组织标本的取材,2.1.2 动物组织标本的取材,动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。,制片所需的材料要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要从活的动物体上采取材料，在一般情况下，要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。,动物的选择,动物的选择是组织切片取材的第一步,在组织学中以人的组织为理想，但人的组织不易得到，根据研究的需要，大都以动物的组织来代替。有些动物的组织器官比人的组织更为典型，如：猪的肝脏；豚鼠胰腺、内耳；猫的肋间肌显示运动终板；兔的皮下组织和肠系膜作活体染色较为理想等。,动物的处死,（1）吸入麻醉法：将浸透乙醚的棉花放入玻璃缸内,将 动物放入玻璃缸内,盖上玻璃盖，观察动物麻醉情况，放血处死，此法用于小动物。 （2）注射麻醉法：用3%戊巴比妥钠按每公斤体重12ml静 脉注射或腹腔注射，麻醉后立即放血处死，此法用于大动物。 （3）直接处死法：用金属器械猛击动物的后脑部或直接断头放血处死，此法适合于小动物。,2.1.3 组织取材注意事项,1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学研究。动物放血处死后立即取材，最好在心脏还在跳动时立即取材，马上投入固定液中； 2.注意防止人为因素的影响 切取组织的刀剪必须锋利，刀要足够长。切分组织块时，不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压。以免损伤组织； 3.组织块的大小 厚为0.20.5cm，大小可根据需要而定。柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2 3h，等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。,4.取材应注意清洁，组织块上如有血液、污物和粘液沾着，应用生理盐水洗涤后再入固定液。 5.取材时间：原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。 6.注意确定取材部位和包埋切面的方向，切除不需要的部分。 7.明确编号，登记,新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一种方法，将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。化学固定法就是用化学试剂配制成固定液使组织固定。 固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣，除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。,2.2 组织标本的固定, 防止组织自溶和腐败； 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构； 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色； 固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。,固定的目的和作用在于：,（1）小块组织固定：从人体或动物取出组织，切成小块投入固定液中固定。 （2）局部注射固定：某些组织和器官其固定液不易渗透或渗透较慢，渗透不均匀，还有些器官为保持外型或卷缩，可采取局部注射固定方法，固定46小时后，再将组织切成小块继续投入固定液中固定。 （3）整体注射固定：此法主要用于科研和大体解剖，亦可用于组织学教学制片。,固定的方法,固定液的种类很多。可分为两大类：单纯固定液和混合固定液。 单纯固定液：是用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液有一定局限性。 混合固定液：是用几种化学试剂，按一定的比例混合配制而成的，由于各种试剂的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。,固定液的选择,（1）甲醛固定液： 是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%40%，配成固定液的浓度为4%，习惯上称为10%，配制时取甲醛原液10ml，加蒸馏水（D.W）或缓冲液至100ml，为甲醛固定液（10福尔马林） 。 甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH为7.6，能长期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水中冲洗24-48小时,否则影响染色效果。,(2) 4多聚甲醛固定液 最好是动物经灌注固定取材后，继续固定2-24h。该固定剂较为温和，适用于组织标本的长期保存。 (3) BouinS液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 是常用的良好固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，不使组织变硬变脆，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为1224小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。,（4）Carnoy氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间24小时，它是细胞极好的固定液，适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。,(5) PLP固定液： 过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 (6) Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存备用，对核内抗原的保存效果较好。 (7)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而发生固定作用。酒精是一种还愿剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。,注意事项：,1. 根据材料的性质和制片的目的选择固定液。 2. 一般固定液都以新配为好，有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合。配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 3. 固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次固定液。 4. 材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，以免相互混淆。 5. 标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。,2.3 组织脱水、透明,脱水(Dehydration): 由于石蜡不溶于水，因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需先用乙醇类试剂进行脱水。脱水是用一种既能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。如用浓度逐渐升高的酒精 (70-100%)将组织中的水完全置换出来。,现最常采用的脱水剂是乙醇，进行梯度脱水，此外， 丙酮、正丁醇、松脂醇等也可作为脱水剂。脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。 脱水的过程： 50%乙醇70%乙醇80%90%100% 100%乙醇 脱水应逐步进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。,注意事项： 1. 在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 2. 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 3. 如需过夜，应停留在70%酒精中。 4. 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象,透明（Clearing）: 脱水后，组织内含有大量的乙醇。由于石蜡不溶于水，也不溶于醇类试剂。因此，必须用一种既能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件，该过程即透明。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定,注意事项： 1.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 2.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3.在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。,浸蜡（Infiltration）: 目的：除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。 方法：将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用液态石蜡完全置换出组织块中的透明剂，最后，组织细胞内被大量石蜡支撑，室温时石蜡凝固成固态，使组织能用于石蜡切片。,2.4 浸蜡,注意事项： 1. 尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度； 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 2. 操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。 3. 透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在5560左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。,水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯和石蜡可以相溶。 因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。,我们可以看到：,2.5 包埋,将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。 用于包埋的石蜡的熔点在5060之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为5256。 操作过程： 包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。,常规石蜡包埋过程,(1)固定：10%福尔马林24h48h，流水冲洗 (2)脱水：75、85乙醇，95乙醇、，无水乙醇、。 (3)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯 (4)浸蜡：二甲苯/石蜡、石蜡、石蜡 (5)石蜡包埋：修蜡块，标号,修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。 固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。 切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。 贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。,2.6 切片,切片: 用切片机将组织切成510m厚的蜡片，然后将其放到温水上，待其完全展开后，裱到有粘附剂的载玻片上。,切片前的准备工作,(1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂粘合剂。如需开展原位杂交，还需将玻片240烤2h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片丙酮5min APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。 铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O 1000ml 蛋白甘油：,切片要求及注意事项：,(1)切片刀要快，切片厚510m。 (2)切片按序贴在玻片的下1/3。 (3)5260烤片。 (4)编号 (5)切片可在4保存数年（石蜡切片） (6)冰冻切片后需凉干后立即固定 (7)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h后冰冻切片。,组织学制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。,2.7 染色,根据来源分 (l)天然染色剂 此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋红。 (2)合成染色剂 全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。 除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。,2.7.1 染色剂的分类,根据用途分为： (l)细胞核染色剂 用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。 (2)细胞质染色剂 用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。 (3)脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。,根据染色剂的化学性质分为： 碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。 碱性、酸性和中性染色剂都是由一种酸和一种碱所构成的盐类。 碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别，就在于染色剂的主要有色部分是阳离子还是阴离子。若染色剂电离后，其分子的主要部分成阳离子为碱性染色剂；若电离后，其分子的主要部分为阴离子即为酸性染色剂。,染色的物理作用 此理论认为组织细胞的染色主要是依靠下列三种物理作用的一种或全部，使染色剂进入组织或细胞内。 (1)毛细管作用及渗透作用 但染色剂与组织细胞没有牢固的结合 (2)吸收作用 又称溶解学说。这种学说认为组织细胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织吸收染色剂，牢固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同。,2.7.2染色原理,(3)吸附作用 吸附作用是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液(染液)中吸附一些小颗粒(化合物或离子)到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。,染色的化学作用 化学作用的主要理论根据 是染色剂的性质可分为酸性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内般也可区分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸性的组成成分故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红)的亲和力很大，易于着色。,HE染色基本技术,苏木素与伊红对比染色法（简称HE对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。,一、石蜡切片脱蜡至水,在染色前，需要脱蜡入水，因为染料是水溶性的。冰冻切片从-80取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行染色。 石蜡切片需经如下脱蜡：,脱蜡步骤： 二甲苯 10min， 37二甲苯 10min，37 无水乙醇 2min，无水乙醇 2min， 95乙醇 2min，85乙醇 2min，75乙醇 2min， 流水冲洗。,二、染色,染色(Staining): 染料可以将微观结构显示不同的颜色以便观察鉴别。,染色方法,即苏木精和伊红染色（简称 H E 染色） 苏木精(hematoxylin)： 紫蓝色，碱性染料，可使细胞核和胞质内的嗜碱性物质（RER、游离核糖体）着蓝紫色。 伊红(eosin)： 红色，酸性染料，可使细胞质基质、溶酶体等大多数细胞器，以及细胞间质内的胶原纤维等着红色。,1、普通染色,染色方法,HE染色,苏木精,伊 红,嗜碱性结构： 细胞核 粗面内质网 游离核糖体等,嗜酸性结构： 细胞质基质 溶酶体、线粒体等细胞器 胶原纤维等,在染色后，重新进入酒精和二甲苯，最后用中性树胶封片，以便长期保存。 * 切片: 固定 梯度酒精上行 二甲苯 石蜡。 * 染色: 石蜡 二甲苯梯度酒精下行 水。 * 保存: 水 梯度酒精 二甲苯中性树胶。,最常用的染料是苏木素(Hematoxylin, H)和伊红(Eosin, E)。 * 苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性(Basophilic)。,* 伊红是酸性染料，粉红色。可以将大多数细胞的细胞质染成红色。被伊红着色的结构本身为碱性，具有嗜酸性(Acidophilic)。 * 不易被苏木素和伊红着色的结构具有嗜中性(Neutrophilic)。,石蜡切片&HE染色,其他染色法: 硝酸银神经细胞(黑), 醛复红弹性纤维(紫), 甲苯胺蓝肥大细胞(紫红色),PAS染色：糖分子过碘酸乙二醛基Schiff试剂紫红色,苏木精 4g 无水酒精 25ml 10铵明矾(硫酸铝铵)水溶液 400m1 配制时先将苏木精溶于无水酒精，待先全溶解后加入10铵明矾水溶液，充分搅动混合后，注入细口瓶内，瓶口用纱布封住。然后将瓶置于温暖有光处34天后过滤，滤后再加入100m1甘油和100ml甲醇，混合均匀后，瓶口仍用纱布封口，再置于光线充足处12月使之成熟。待颜色变成紫褐色时即为成熟。成熟后过滤，塞紧瓶口置于阴凉处贮存，可长期保存，多年不坏。此液着色力较强，染数分钟即可。也可用染液l份加蒸馏水35份稀释后使用，染色时间需延长一至数小时。此液染细胞核及嗜碱颗粒效果良好。染植物细胞的纤维壁比用其它任何染液着色更好。,附：染色剂和染色液的配制,步骤如下： 二甲苯二甲苯1/2二甲苯+1/2乙醇混合液100%乙醇95%乙醇85%乙醇70%乙醇苏木精染液0.01%盐酸自来水70%乙醇85%乙醇伊红染液95%乙醇100%乙醇100%乙醇1/2二甲苯+1/2乙醇混合液二甲苯二甲苯封片,