《发酵车间消毒培训》PPT课件

发酵车间消毒培训,焦江涛,车间培训课件 焦江涛,一、消毒与灭菌,消毒与灭菌在发酵工业中均广泛应用。 1、消毒：。是指用物理或化学的方法杀死物体上的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 2、灭菌：是指用物理或化学的方法杀灭或除掉传播媒介上的所有微生物（包括芽孢），使之达到无菌程度。在生产上习惯叫做消毒但它与消毒是的严格意义上的区别。,车间培训课件 焦江涛,二、灭菌方法 灭菌的方法主要有：干热灭菌法、湿热灭菌法、化学药品灭菌法、过滤除菌法、过滤除菌法。根据灭菌的对象和要求选用不同的方法。 1 干热灭菌法 干热灭菌法是指在干燥高温条件下，将微生物杀死。干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒的作用，其中氧化作用是主要的。干热灭菌必须高温，工业生产中采用的条件是摄氏160，1h。主要使用于需要保持干燥的器械、容器的灭菌。生产实例：在接种操作和镜检涂片时用的灼烧灭菌法就是最简单的干热灭菌法，在投罐前的空消（125、30min)也属于干热灭菌，,车间培训课件 焦江涛,所以在空消之前必须先把PH、溶氧电极拔掉，否则会大大削减其使用寿命。 湿热灭菌法 湿热灭菌是借助蒸汽释放的热能和水的参与，能使微生物细胞中蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键（特别是氢键）受破坏，特别是蛋白质发生不可逆的凝固性变性，使微生物死亡。蒸汽在冷凝时释放出大量潜热，具有强大的穿透力，尤其适用于大量培养基及发酵设备的灭菌。 温热灭菌与干热灭菌相比具有以下特点： (1)湿热灭菌时，菌体蛋白质吸收热量容易变性凝固； (2)湿热的穿透力比干热大（如表1所示） (3)蒸汽冷凝时放出大量潜热，温度上升快； (4)蒸汽制取简便、成本低、数量大，适于工业生产。,车间培训课件 焦江涛,高温灭菌也会给培养基带来一些不利影响，所以在生产中就要求我们在实消时一定要严格按工艺要求来控制实消的温度和时间。超温超时对培养基的破坏主要有两种情况：一造成培养基成分相互作用；二造成热稳定性差的原材料严重破坏。前者在降低培养基质量的同时还会引起培养基褐变、沉淀，褐变反应包括类黑色素褐变 （主要是氨基化合物与羰基化合物在加热条件下生成棕红色的色素），焦糖化褐变（糖在没有含氨基化合物存在下，加热到其熔点逐步形成焦糖），糖类破坏后易和有机氮源结合，产生氨基糖，,车间培训课件 焦江涛,对微生物产生一定的毒性，严重时将抑制微生物的生长发育破坏整个发酵所以在一、二步种子罐时，一旦发现料液发黑会发现其菌量很少，产糖或产酸会大受抑制甚至造成代谢停滞，严重时不得不倒罐。沉淀主要是在加热情况下，培养基中的钙铁离子等成分易与磷酸盐碳酸盐发生反应生成无机物沉淀和无机物如多肽类沉淀。后者会使玉米浆和酵母膏中的微量元素、蛋白质及糖类遭到破坏，通常解决方案 如下：分开灭菌。对培养基中糖类等不耐高温的成份与培养基其它成分分开灭菌，冷却后再混合比如我们的二步糖采取流加而不是放在一起实消；将培养基中的钙铁等离子成分与磷酸盐分别灭菌可以避免发生沉淀反应低温灭菌，低温灭菌几乎对培养基中的营养成分没有破坏。如我们一步的糖。培养基在达到完全灭菌时，灭菌温度和灭菌时间对维生素C培养基养分破坏的比较：,车间培训课件 焦江涛,车间培训课件 焦江涛,3 化学药品灭菌法 一些化学药品易与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活，破坏细胞膜透性而杀死微生物。根据灭菌对象不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。如我们车间环境消毒用的浓度为1%-0.25%的高锰酸钾溶液或0.25%的漂白粉，发酵罐发酵至终点前加入0.25%的新洁尔灭和染菌后加入0.15%-0.17%的甲醛熏蒸、加入5%的氢氧化钠浸泡，进入无菌室操作前人双手用75 %的酒精消毒。 三 投罐前的几点注意事项 发酵是否成功，很大程度上决定于准备工作，以下几点须注意： 1、清洗发酵罐，特别要注意死角的洗刷和与外界接触的零部位的清洗，清除罐底上批料的堆积物。 2、检查取样阀的密闭性有无关不严或滑丝现象，罐体、法兰、轴封、移种阀、移糖阀、视镜等有无渗漏、穿孔、堵塞、死角等情况，并用肥皂水或洗衣粉水严格试漏。隔膜阀更是要定期拆检。,车间培训课件 焦江涛,3、有机械搅拌装置的发酵罐一定要擦干轴封支承内的积水，气升式发酵罐的罐顶部和视镜处要经常保持干燥清洁。 4、检查冲视镜管是否畅通，冲视镜阀是否内漏，发现问题要彻底处理。 5、检查罐上的仪表指针的灵敏度，是否归零显示有无偏差。 6、检查与罐上相连接的螺丝是否有脱丝现象，破旧的及时换新 四消毒过程中的注意事项 1、首先要结合配料工共同确认本批罐所用的原料为合格品，发现有结块、变质的原料拒绝使用。,车间培训课件 焦江涛,2、在用泵向罐中打配制好的培养基时要注意保持稍开些进气，让料翻腾，以防（前期）培养基浓度过大沉淀粘附在罐底。 3、打完料后首先调至适宜的PH，再确认一下所有的培养基都已加入后封住罐口，开始从进气口、放料口、取样口等分路进入蒸汽。各路保持均衡进汽，防止短路 和堵塞，排气要畅通，排汽量不宜过大，以节约蒸汽。 4、在实消过程中要保持压力的稳定，不宜突然卸压升压以防造成大量泡沫冒顶或逃料。 5、在实消控制时原则上以温度为准，压力为辅。但是在保压时可能出现压力表与温度计不对应的情况， 在不能确定到底是温度计还是压力表失灵时，当压力表显示压力大于等于0.1Mpa,而温度,车间培训课件 焦江涛,不到121时，以温度计为准；反之，则以压力表为准 ，总之要确保压力与温度都达到灭菌要求。 6、如遇蒸汽压力突然升高，罐温超过规定，可适当缩短灭菌时间；如遇蒸汽压力突然下跌，一时上不来，温度下降到规定范围以下，可适当延长灭菌时间，以确保灭菌彻底。严防高温高压闷罐，否则容易造成培养基成分破坏和PH值升高。 7、在实消结束降温时在确定空气过滤器的压力大于罐压时，可以先打开空气进气阀，再开冷却水阀以防外界空气倒吸进去。 8、在降温过程中严防大开排气阀使罐压几乎跌零，特别是种子罐装料系数较大，这样做会使料液翻腾剧烈产生大量的泡沫，易出现冒顶或逃料。 9、在消移种管道时要确保整个管道打气畅通，严防堵塞,车间培训课件 焦江涛,或排气不畅。在消好后，通入无菌空气（即给管道降温又能使管道内保持正压）。 10、移种结束后要把发酵罐调至正常培养状态并交给看罐工，打扫完现场卫生后方可离开。 五、染菌原因分析 发酵工业自从采用纯种培养以后，产率有了很大提高，然而防止染菌的要求也更高了。染菌是发酵工业的致命伤，轻者影响产率、提取收率、产品质量和三肇废治理，严重者造成倒罐，浪费大量原材料，造成严重经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。 在发酵染菌之后，必须分析染菌原因，总结发酵染菌的经验教训，把发酵染菌消灭在发生之前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的最重要措施。 （一）不同染菌时间对发酵的影响 1、种子培养期染菌,车间培训课件 焦江涛,种子培养主要是生长繁殖菌体，菌体浓度低，培养基营养丰富，比较容易染菌，带进发酵罐中危害极大，应严格控制种子污染。当发现种子染菌均应灭菌后倒入地沟，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。 2、发酵前期染菌 发酵前期主要是菌体生长繁殖，代谢产物较少，这个时期容易染菌，一旦污染杂菌会迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧分，严重干扰生产菌的生长繁殖和产物的生成，要特别防止发酵前期染菌。紧急处理措施：如果污染危害较大的杂菌不能继续运转，必须重新灭菌。重灭前可适当放出部分发酵液，并补入适量的培养基特别是氮源使消后的培养基符合发酵要求，低灭后调节好PH后重新移种或倒种。,车间培训课件 焦江涛,如果污染的杂菌无大的影响，可以继续运转，但要密切注意发酵过程的代谢情况和杂菌的变化，必要时可适当降低罐温、空气流量、和控制补料量进行发酵。 3、发酵中期染菌 发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有些杂菌繁殖后产生酸性或碱性物质，使PH值异常变化加碱突增或骤减，糖、氮消耗迅速，菌体自溶，发酵液发粘或浑浊，产生大量泡沫，代谢产物的积累迅速减少或停止或下降，有的发酵液发臭。发酵中期染菌，由于营养成分大量消耗，一般挽救处理困难，危害性很大常用的方法有：降低罐温，控制残糖量，降低空气流量或冷置待放。对于这种罐批在核算提取成本和一定滤速（一般不低于5ml/5min)时放罐，否则难以过滤，增大提取工作量甚至无法过滤而放弃。如果中期染的某些,车间培训课件 焦江涛,杂菌不太严重情况，可以采取补加抑菌剂的办法控制杂菌的生长繁殖，如二步发酵染酵母菌可加4-5.6kg的硫酸铜抑止酵母生长，革兰氏阳性菌对青霉素和磺胺类抗生素敏感而阴性菌则不敏感，革兰氏阴性菌对链霉素、氯霉素和四环素等敏感而阳性菌则不敏感。霉菌发酵中染细菌可加入适量的青霉素来杀灭细菌。 4、发酵后期染菌 发酵后期产物积累较多，糖等营养物质接近耗尽，如果染菌不太多，可继续进行发酵；如污染严重，破坏性较大，可以采取提前放罐。,车间培训课件 焦江涛,（二）不同染菌规模的原因分析 1、当发酵出现连续染菌或大面积染菌，一般是公用系统有问题，特别是空气系统。总空过滤器失效可效率下降，新装的空过要避免因为介质移位或翻动而造成空气走短路。 接种和中间补糖设备系统有渗漏和死角，也会造成大面积染菌因此要按时检查维修相关设备。 2、部分发酵罐染菌，发生在前期可能是灭菌不彻底或种子罐带菌所致，同时也与公用接种设备系统有关；染菌发生在中后期，一般与补料、加碱有关。 3、个别罐连续染菌时要检查该罐设备的各个部件，查找有无渗漏和死角，如降温盘管穿孔是造成染菌的多见原因之一。个别罐批偶尔染菌，原因比较复杂，要针对具体情况，视染菌时间和染菌类型，从操作到设备作具体分析。,车间培训课件 焦江涛,（三）从染菌类别上分析原因 1、染革兰氏阳性杆菌、酵母菌等其它杂菌多是由空气系统中带入而造成污染也有可能是种子带菌 2、染革兰氏阴性杆菌、特别是球菌大多数因设备渗漏所致，带菌的冷却水或污水，从冷却盘管、连接法兰、衬里焊缝中渗漏进入发酵罐培养基中。 3、染耐热的芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底但并不是绝对的，空气带菌也常引起染芽孢杆菌； 4、染霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题 六、染菌的途径和防治 （一）种子带菌及其防治 种子带菌的原因： 1、培养基及用具灭菌不彻底 菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行，造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度还达不到要求。,车间培训课件 焦江涛,2、菌种在移种过程中受污染 菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行的。当菌种移接操作不当或管理不严，就可能引起污染。 3、菌种在培养过程或保藏过程中受污染 菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有一定的长度，培养和保藏温度不宜变化太大。在放入摇床后要经常去检查种母摇瓶的状况。 （二）无菌空气带菌及防止 空气净化系统失效或空气精过、预过减效是发酵染菌的主要原因之一。具体防止措施：定期更新主空气系统的过滤介质，加强平时系统的排污除水,车间培训课件 焦江涛,特别是在多雨或潮湿的天气。确保进入车间之前的空气升温至35-45，使相对 湿度下降，定时拆检空气精过、预过。 （三）培养基和设备灭菌不彻底带菌及防止 培养基和设备灭菌不彻底的原因，主要与以下几个方面有关 1、原料形状 一般稀薄的培养基容易灭菌彻底，而含有固体颗粒或粘稠状物料时容易由于灭菌不彻底而造成染菌。这就要求在投料时确保搅拌混合均匀。 2、实消时未充分扣除罐内空气 实消时罐内空气未完全排除造成假压，使罐顶空间局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。因此在实消升温时，应打开排气阀门及有关,车间培训课件 焦江涛,连接管的边阀、罐顶部的接管边阀，使蒸汽通过达到彻底灭菌。 3、设备管道存在死角染菌及防止 由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能到达预定部位，这就是死角。所以发酵罐要合理简化安装管、阀。凡不合理的管、阀、开孔都要坚决去掉，遗留的孔眼要焊平，消除隐患。管道之间尽可能用焊接来代替法兰，不能用直角弯头，要保持管道畅通、光滑、密封。主要阀门及其垫应经常检查更换。 4、设备渗漏引起染菌及防止 发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、摩擦、振动或憋压等原因，往往会造成渗漏。例如：,车间培训课件 焦江涛,设备的表面或焊缝处有砂眼，由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔；冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂缝而渗漏。防止措施：要选用优质材料并经常检查，小渗漏不易发现时可压入碱性水，在可疑的地方用浸湿的酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布显红色。 5、操作问题 在发酵过程中如操作不当也引起染菌，如移种时或发酵培养时罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫冒顶而造成染菌；压缩空气压力突然下降使发酵液倒流入空气过滤器而造成染菌等等；防止措施：加强对一线操作人员的无菌操作培训和始终贯彻无菌操作制度及责任心教育，加强管理措施。,车间培训课件 焦江涛,（四）、环境卫生 发酵车间和菌种室的内外环境，必须保持干净整洁，定期清扫和消毒，车间周围不得堆放废弃物，不允许有活菌排放，有异味或易飞扬的物料的贮存，应远离发酵车间和菌种室。 七、染菌的检查 （一）感官检查 1、大部分染菌的发酵液可以从发酵的异常情况来检出，如色泽、异味、变稠或变稀、加碱速率、菌丝变形产酸不正常或不产酸或倒酸而糖却消耗很快。 2、借助显微镜，常用梅兰染色、结晶紫染色和革兰氏染色来判断。 （二）、无菌平皿划线检查 平板检查法既可检查出杂菌污染，又可以检查出有无噬菌体污染。检查杂菌时，先将灭菌后的培养基倒入已经灭,车间培训课件 焦江涛,菌的培养皿内，冷却后置于37恒温箱内培养24小时，进行镜检。或者将待检样品置于37培养6小时，使细菌生长，增加数量，然后再划线接种培养。这样可以提高平板法的灵敏度。 （三）肉汤培养检查法 主要用于空气系统和培养基染菌的检查。具体的做法是将培养液装在吸所瓶中，灭菌30分钟后，置于37培养24小时，如无混浊即可用于上述两项的检查。将无菌空气或灭菌后的培养基引入后保温培养，观察有无混浊现象发生，如呈现浑浊说明染菌 八、染菌的后续处理 染菌查找到原因后，对罐彻底清洗干净，加入甲醛,车间培训课件 焦江涛,空消,