干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测

三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于5 mL聚苯乙烯培养瓶(Nuncln）中培养.完全培养基中加入能诱导M 向软骨细胞转化的诱导因子： （一致统一的诱导物质)转化生长因子10ml，(左旋）维生素 C 50 m/L（也有0.1m/L)地塞米松 0.1mlL （也有1 nmlL)IT50/ml丙酮酸钠 1mmol/亚油酸 53ugmg牛血清白蛋白 125ngml。倒置显微镜逐日（13weeks）观察细胞生长情况.细胞长成单层后进行传代。细胞培养3周。去除培养液，晾干,细胞用通用型胶原检测试剂盒（晶美生物工程有限公司） 免疫组化，按试剂盒说明书操作;用alcia bue 孵育 min， 流水冲洗min ，麦氏苏木素复染5 m ，流水冲洗2 mn ，晾干,显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积.或者用甲苯胺蓝染色,具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的:SC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测:培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液,0%甲醛固定h，自来水冲洗1min，双蒸水冲洗1次，滴加1甲苯胺蓝染液于培养皿内,染色3h,加人5乙醇,洗去多余的染液，烘干,中性树胶封片.诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清 、1 ml/L 地 塞 米 松 、50 mol抗 坏血酸、0 mmol/ - 甘 油 磷 酸钠 的高 糖 DEM培养基进行成骨诱导培养,进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测： 碱性磷酸酶组织化学染色： 取成骨诱导 1 d的细 胞 , 40 g/L中 性 甲 醛 固 定5 min， Gmori改良钙钴法染色。取5块玻片， 每片随机取2个视野, 采用网格计数法,计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比.碱性磷酸酶活性检测：取第3 代细胞， 以 1105/孔的密度接种于孔板中， 分别成骨诱导 3， 5，7, 10，12， 14 d，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测.钙结节染色: VKossas矿化结节染色法 原理是将矿化基质中的磷酸盐（钙）、碳酸盐（钙）转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。Van koss银染色法试剂: 1。2硝酸银水溶液:硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。 2硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g,蒸馏水加至10 m。培养皿用PBS冲2次，9乙醇固定0分钟，蒸馏水冲洗3次2. 2%硝酸银内置暗处1小时3。蒸馏水冲洗次,再流水冲洗1分钟。 还原1小时(硫代硫酸钠5g，氢氧化钠02l，蒸馏水100ml）5. 5硫代硫酸钠小时1。固定后的细胞爬片用0。1ml/L B（H7.4)洗涤遍； .浸入5(也有)硝酸银水溶液中0m,日光或紫外光曝晒104in,蒸馏水洗涤； 3.浸入5次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗)溶液中,蒸馏水洗； 1中性红衬染1 in，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80%9511102），二甲苯透明，中性树胶封片。l 。 Section towater.切片脱蜡至水2. Place sctions i 1 silertr soluto undult vioetliht o 45 minues置于硝酸银溶液在紫外光下5分钟。ash in stilledwater。 蒸馏水漂洗4. Trawith 3sodim thisulphate for inute 3硫代硫酸钠处理分钟。Wsh n water。 用水漂洗6。 Cntestanwith vanGieonfor miutes. Van ieson复染5分钟7.Was i alcohol. 乙醇漂洗8. er . Mun sctio n DP 透明封片 结果:钙盐沉积区域呈黑色，背景红色A 组以现行报道方法染色:4 多聚甲醛固定标本 ,1 硝酸银溶液紫外线下染色 10，用5 %硫代硫酸钠染色 2mi ，1 %中性红复染1mn ，酒精冲洗后观察.B 组以改进的方法染色： 多聚甲醛固定标本，5 硫代硫酸钠孵育 30min，蒸馏水冲洗 ，然后用1%硝酸银溶液紫外线下染色0mn ，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质 ,继续用 硫代硫酸钠染色 mi ，1 中性红复染 0mn ，蒸馏水漂洗后观察。或取成骨诱导1 的细胞， 体积分数为095 的乙醇固定 15 min,10 g/L 茜素红 S染液在室温下浸染 10mi, 去离子水洗涤3次， 倒置显微镜下观察。二、茜素红染色茜素红中文名称: 茜素红英文名称：aiarined ; oiualizarn slfonateCAS： 10-223分子式： 47aO7H2O分子量: 360。28中文别名: 9，10-二氢-,4二羟基9,10二氧代2蒽磺酸单钠盐； 茜素红；（3) 茜素磺酸钠 ；茜素S ;酸性媒介茜素红;酸性媒介红S80（id Monat s80）；C.媒介红3（C I。 ordn ed 3）。性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯.1水溶液pH2.1。由茜素经发烟硫酸磺化,然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂;光度法测定金属离子的显色剂;酸碱指示剂,第一变色范围H值37（黄）5.2(紫）,第二变色范围H值11(紫）12。0（浅黄）；用于极谱法测定金属离子.用途： 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。配制：将托盘天平上称取0。g茜素磺酸钠定溶于100l蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。 或用茜素红粉加P溶解后,要注意调节值到7.！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HC（PH83)， Tis的浓度做分子生物学一样的,用01molL的HI或。1%的NH调节。茜素红染液配方配方一茜素红染液（）取冰醋酸毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液.配方二 茜素红溶液（)取1克茜素红,溶于10毫升9酒精中，搅拌,然后跟900毫升1氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液？茜素红(Fluka)溶于6%乙醇中配成。12的茜素红液。配方三0.1的茜素红配TrisHCL（PH80) 具体配制方法1 ris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100m中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇）,一滴滴地加,边加边测试P，待PH为8。3左右即可(无精密P测试仪，用H试纸也是一样的,但是要能测到8点几的P试纸）,配好后往里面加0.1g的茜素红,便得到0.1茜素红riHc( 83）溶液。茜素红染色步骤1、弃培养基,培养皿用PBS冲洗2次，2、95% （也有9%)乙醇固定1030mi,蒸馏水冲洗3次3、 。2%（or 0.)茜素红茜素红-TriHl（ 83)染色，37，30in，用清水冲洗。在低倍镜视野（4 10） 下进行矿化结节计数钙染色法-茜素红法 染色步骤 1。茜素红染液5分钟 。 用丙酮洗20分钟 3 丙酮:二甲苯（：)溶液20秒4. 树胶封固 结果：钙累及物呈桔红色型胶原免疫细胞化学染色(成骨特有）取成骨诱导 7 d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗,4 丙酮固定 10 i，磷酸盐缓 冲 液 洗3 次, 5mi/次 ; 体 积 分 数为0.03 的过氧化氢孵育 10in， 磷酸 盐 缓 冲 液洗3 次, mn/次； 血清封闭液封闭 5 min， 倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的型胶原抗 4 过夜， 磷酸盐缓冲液洗3 次, 5 n/ 次;兔抗羊抗室温 1 ， 磷酸盐缓冲液洗3 次,5 mn/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温15min,磷酸盐缓冲液洗 3 次， in 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。诱导脂肪方向分化诱导分化细胞以每毫升 104 ，接种于培养皿中 ，细胞达到8 汇合后更换成脂诱导培养液（LDMM 培养液 ,0 BS ，地塞米松 106mol/ ， 胰岛素1 m/L ， 3异丁基-1甲基黄嘌呤(3sobutyl1methylxatine,BMX 0 ml/ ，吲哚美辛 0.mml/），对照组继续加常规培养液 ，每 天换液一次。在诱导6 、9 、1 、15 、18d 时各取各组细胞进行油红 O 染色 ，光镜下观察并摄影。油红O配方油红O1，异丙醇10ml或70酒精00 ml，将油红放入烧瓶于水浴中加温溶解或放入温箱中603m，用前过滤,临用时取油红O0m，蒸馏水10m,两者混合后立即变成鲜红色液体,静止30 n后过滤使用。油红O染色固定于10%中性甲醛溶液内12d。蒸馏水洗冰冻切片 00m入蒸馏水。用080异丙醇或酒精稍洗或用蒸馏水稍洗.入油红O 染色152min.入异丙醇或酒精或蒸馏水洗.用苏木素淡染细胞核,充分水洗,用甘油明胶或用PP封固。文中如有不足，请您指教！9 / 9