叶绿素实验报告

叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定食品092一、实验目的：二、产品验收指标 项目和指标1项目丨指标1pH | 9.0 10.71 |E 405nm 三 |5681cm |消光比值 | 3.24.0总铜(Cu), % |4.06.0游离铜（Cu）, %W | 0.025砷(As), % W |0.0002铅(Pb), % W |0.0005干燥失重，% W| 4.0硫酸灰分，% W| 36.01三、实验原理:四、仪器和试剂（一）、试剂：1、蚕沙（50克）2、95%乙醇3、NaOH 溶液4、稀盐酸5、丙酮6、石油醚7、CuS04溶液 8、蒸馏水 9、40%乙醇（纯乙醇与蒸馏水按2:3配）10、5%NaOH-乙醇溶液11、pH试纸12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21： 4混合（二）、仪器：A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成1、 温度计1支 回流冷凝管 1支 500ml 圆底烧瓶 1个恒温槽 1台 滤瓶及漏斗 1个 胶头胶管 1个 玻璃棒 1支100mL量筒 1个 铁架台 1台电热恒温水浴装置 1套2、 减压蒸馏装置1台3、台氏天平 1台4、PH试纸 若干B、叶绿素铜钠质量分析1、751分光光度计 1台2、 台式天平、分析天平各1台3、 玻棒1支胶头滴管1支10mL、50mL量筒 各一个100mL、50mL容量瓶 各1个25mL、1mL 吸量管各一支4 、试纸若干 吸耳球 一个五、实验步骤（一）叶绿素铜钠的合成1、叶绿素的提取：（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60C（防止叶绿素a和b分解），浸 泡提取2小时，滤出提取液。（3）按步骤2用乙醇重复2次。（ 4 ）合并3次提取液，在减压、不超过6 0摄氏度下蒸出乙醇。趁热倾出瓶中液 体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。2、皂化：将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-CHOH溶液调节使其pH=11，用25水浴加热在60 C下皂化回流1小时。3、萃取： 将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分 层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：取上层液少 许置于小烧杯中，加入23倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色 则不完全皂化。取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。平行萃取 3次。4、调酸铜代：将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加 入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60 C 下保温搅拌1小时。趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水， 析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、 40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、 及残留的叶黄素和其他有机杂质。5、成盐：洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH=11， 搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不 显绿色则说明完全成盐），将其在60C下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物， 然后再在60 C下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。流程图:溶 剂 NaOH 溶液 不皂化物 溶剂 酸 CuSO4 溶液 滤渣!fill!水稀酒精 NaOH-离析一沉淀一烘干纯化一成盐一过滤一干燥一成品（二）、纯度分析：1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶 中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇 匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm 波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015% 溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比 色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标 准曲线。2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀， 即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm，吸光比A405nm/A630为 3.24.0。用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶 液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。3 、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸 盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm。 用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。六、实验现象试验操作试验现象备注称取蚕沙50g墨绿色加入去离子水浸润和95%乙醇 60C搅拌回流2h蚕沙部分溶解抽滤，保存滤液得到呈墨绿色的液体剩余蚕沙用95%乙醇再次回流2 次抽滤，混合三份滤液得到呈墨绿色的液体提咼产率水浴，减压蒸馏，把合并滤液放 入旋转烝发仪，并在55 C水浴中 加热蒸馏回收95%乙醇得约50mL左右溶液，溶液 成糊状，蒸发液呈无色防止污染 循环利用在浓缩液中加5% NaOH-乙醇调PH值到11,在温度为60C，皂化时为1h溶液出现小气泡皂化过程皂化后，并洗涤加HCl调，PH = 7 加入 10%CuS0 调 PH = 2- 3,在4搅拌下温度60C，保持1 h左右PH试纸变红色此时慢慢出 现胶状墨色悬浮物叶绿素铜酸趁热过滤，滤渣先用水洗去，再 用95%乙醇洗涤3次后抽干。合 并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏 水，静置过夜后过滤得墨绿色物质 洗涤液呈绿色 固体溶解得绿色液体得墨绿色粉末叶绿素铜钠滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇 及石油醚洗涤3次，放进烘箱中 烘干石油醚层变为浅绿色以除去其中 的H+ Cl及残 留的叶黄素和 其他有机杂质。称取0.010g叶绿素铜钠溶于蒸 馏水配成0.1%溶液，再稀释25 倍，测其pH值除去水分得墨绿色结晶物略有胺味 结晶物0.0483g七、实验数据与处理一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线标准曲线的测定方法：取标准样品配制 0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管 分别精确量取 2.5 mL；2.0mL；1.5mL；1.2mL；1.0mL；0.5mL 移至 5 个加入 100mL 的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4NaH2PO4缓冲液，摇匀定容至 刻度，即 0.0025%；0.002%；0.0015%； 0.001%；0.0005%。以缓冲液作空白对 照，分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405。如表1、图1所示。表1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）溶液百分数（）A4050.00050.1980.0010.3620.00150.5520.0020.7160.00250.924溶液存分禽屋x + 0*0080. 998逼主1L 0015二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线（一）标准样品：取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm的 比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一 次），以缓冲液作空白对照。测定数据如表 2所示，吸收曲线如图 2 所示。表 2 标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长/nm350355360365370375380385390吸光度0.1420.1500.1570.1660.1770.1970.2170.2590.292波长/nm395400405410415420425430435吸光度0.3270.3570.3790.3770.3380.2720.2130.1690.139波长/nm440445450455460465470475480吸光度0.1190.1040.0920.0830.0740.0670.0600.0550.050波长/nm485490495500505510515520525吸光度0.0470.0440.0420.0410.0400.0390.0380.0370.037波长/nm530535540545550555560565570吸光度0.0380.0390.0390.0390.0390.0370.0360.0400.043波长/nm575580585590595600605610615吸光度0.0400.0420.0430.0430.0430.0410.0430.0460.052波长/nm620625630635640645650655660吸光度0.0590.0670.0710.0690.0640.0570.0490.0440.039波长/nm665670675680685690695700吸光度0.0350.0320.0290.0260.0240.0210.0190.017图2标准旧緑素铜钠吸收曲线3 5 2 5 1 * 2 * 1 * O- * O- * O- (V?=丄品）（二）产品： 1 101905 10590610690710取产品配制0.004%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色 杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次）， 以缓冲液作空白对照。测定数据如表 3 所示，吸收曲线如图 3 所示。数据记录: 1、产品的质量是0. 0483g （借第12组：冯奕淇和雷春雨的实验结果）2、产品产率:W=0.0483/50*100%=0.0966%3、吸光比=A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8表 3 产品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表波长/nm350360370380390400410420430吸光度0.0680.0640.0600.0580.0610.0620.0650.0640.057波长/nm440450460470480490500510520吸光度0.0510.0470.0430.0390.0380.0360.0350.0330.034波长/nm530540550560570580590600610吸光度0.0340.0340.0330.0330.0320.0330.0350.0350.035波长/nm620630640650660670680690700吸光度0.0350.0370.0370.0350.0360.0350.0380.0370.035图3叶绿素曲线0.020.030.060.050.040.03)邂来蜜0.01八、实验分析本实验所测得的吸光值相对较小，对比于标准的吸光曲线，在波峰（405nm与 ）0nm）处的值仅为0.065和0.037,比标准吸光曲线的值小了 4%倍。其中的原因 能为：所制备的产品的原因：一个原因是产品的纯度较低；二个是可能产品没有完全烘干，实际用于配制溶液的产品的质量小于称量的质量。配制溶液的原因：由于产品纯度较低，所以相应的用于配制溶液的产品的质量也应该增多，而 配的溶液的含量较小，这可能就造成了所测得的吸光度较小的原因。实验失败的原因：1、蚕沙不过粉碎，可能导致叶绿素溶解不过充分，加乙醇回流时，时间2小时 每次，因浸提不充分，浸提时间不够会导致提取率过低。2、皂化1小时后，用石油醚萃取，上层杂质还是绿色，可能是皂化时间不够，这步导致了大量叶绿素的流失，以致最终产率只有微量而无法配置叶绿素溶液测 吸光度。3、整个实验过程中洗涤与过滤次数较多，而叶绿素盐粘稠易粘附在滤纸上，很 不容易取下，且在洗涤过程也有叶绿素盐的损失。以上两项操作直接影响到产率 的高低。4、调酸铜代这步时，由于保温后趁热过滤时过滤速度比较慢，还没过滤完就用 95%的乙醇边洗涤变过滤，乙醇作用是析出叶绿素的，这就导致了大量的叶绿素留 在滤渣里，而我们实验要的是滤液。5、调酸铜代这步时，由于静置过夜后进行减压过滤，由于叶绿素铜分子太小， 滤纸并不能完全的保留住其在滤饼里而流失过多，使最终产率很少。6、在成盐这步时，加入缓冲液调pH时，由于滴加速度控制不好，使pH超过12，后又用 稀盐酸调到PH=11.55 ；成盐时静置半个钟以上不定期检测是否完全成盐，可是用玻棒点些许 溶液放在滤纸一直都是显淡淡的绿色，这两方面可能导致成盐效果不好。这也是产率低的关 键因素之一。九、参考文献:1. 潘慧娟.不同溶剂对蚕沙中叶绿素提取效果的影响J.杭州师范学院学报(自 然科学版)，2006(1)： 5O52。2. 贾淑梅，王君玲.菠菜中色素的提取及其性质的研究J.喀什师范学院学报， 2002， 23(3)： 48493. 严桂芹，章世元，王俊琴，等.蚕沙叶绿素的提取及分析测定J.林业科技， 2008，33(4): 6O一62.4. 孙彩云，王巍杰，刘淑萍.蚕沙制备叶绿素锌钾盐的工艺研究J.化学与生 物工程， 2005， 22(5)： 33345. 颜杰，李富兰，高瀚云，等.蚕沙中叶绿素铜钠盐和果胶的提取研究J.食 品科技， 2008， 33(3)： 1771796. 于善凯，沈凤明.蚕沙叶绿素提取废渣中黄酮类化合物的提取工艺优化J.食 品研究与开发， 2007， 28(5)： 46487. 凌关庭、王亦芸、唐述胡，食品添加剂手册(上册)M：北京：化学工业出版 社， 1989. 2508. 凌关庭、王办芸、唐述潮，食品添加剂手册(下册)M 北京：化学工业出版 社 1989 .314-315