法医毒物分析-常用仪器分析.ppt

9月14日2005年,9月14日2005年,常用仪器分析(1),9月14日2005年,9月14日2005年,第一节 光谱分析法 一、紫外-可见分光光度法 （一） 光吸收定律 （二） 紫外-可见吸收光谱 （三） 紫外-可见分光光度计 （四） 方法与应用 二、荧光分光光度法 （一） 基本原理 （二） 荧光分光光度计 （三） 方法与应用,9月14日2005年,9月14日2005年,三、红外分光光度法 （一） 傅里叶变换红外光谱仪 （二） 特征吸收区域 （三） 方法与应用 四、原子吸收分光光度法 （一） 双光束原子吸收光谱仪 （二） 方法与应用 五、有机质谱法 （一） 质谱仪 （二） 质谱图和离子峰 （三） 应用,9月14日2005年,9月14日2005年,第二节 色谱分析法 一、分离原理 （一） 分配平衡 （二） 保留参数 （三） 理论塔板概念 （四） 范氏方程 （五） 分离度 二、薄层色谱法 （一） 色谱展开与比移值 （二） 固定相与展开剂 （三） 方法与应用,9月14日2005年,9月14日2005年,三、气相色谱法 （一） 气相色谱仪 （二） 气相色谱柱 （三） 检测器 （四） 气相色谱-质谱联用仪 （五） 方法与应用 四、高相液相色谱法 （一） 高相液相色谱仪 （二） 色谱固定相和流动相 （三） 方法与应用,9月14日2005年,9月14日2005年,五、电泳法 （一） 基本原理 （二） 区带电泳 （三） 毛细管区带电泳,9月14日2005年,9月14日2005年,光与光谱 紫外可见分光光度法的基本原理与定性定量基础、分析方法、条件及适用范围。 荧光分光光度法的基本原理、特点和用途。 红外吸收光谱法及优缺点 质谱、质谱仪、质谱图及应用 色谱法概述 基本原理及方法分类,9月14日2005年,9月14日2005年,薄层层析法 方法及特点。展开剂、层析板、定位法的类别。常用薄层系统及适用范围。定性定量方法。薄层扫描法简介。 气相层析法 方法及特点。固定相类别，检测器类型及性能。定性定量方法与适用范围，毛细管柱法简介，气一质联用简介。 高效液相层析法 方法与特点。固定相、流动相类别与层析系统的类型及应用。 电泳法的基本原理区带电泳毛细管区带电泳,9月14日2005年,9月14日2005年,要 求,熟悉各分光光度法的基本原理、特点及在法医毒物分析中的应用。熟悉各种色谱法的固定相、流动相、色谱系统类别、检测手段及应用，掌握色谱法的原理及应用。,9月14日2005年,9月14日2005年,分光光度法（Spectrophotometry),属于光学分析法，是以光与物质间能量交换产生的光谱为基础建立起来的一类分析方法。既可用于化学成分分析和结构鉴定，也可用于含量测定，是药毒物分析中常用的定性定量分析手段之一。,9月14日2005年,9月14日2005年,光与光谱,光的本质 属于电磁辐射，传播能量，具有波粒二象性。各种光本质区别就是频率不同。每一种光有其确定不变的频率,因真空中光的传播速度相同，故各种光在真空中有其固定的波长。 = c / 常用真空中的波长来标记各种不同的光。,9月14日2005年,9月14日2005年,光的能量辐射能,光（电磁辐射）的能量是由不连续的光子（photon)或称光量子流传播的（波动性和粒子性）。光子的能量大小取决于光的频率。 E 光子= h （h plank常数） 频率越大或波长越短的光，其能量就越大。,9月14日2005年,9月14日2005年,光与物质间的能量转移是通过吸收或发射光子来完成的。,9月14日2005年,9月14日2005年,物质的能量,构成宏观物质的原子、离子和分子及其内部的微粒，都处于运动中。运动着的这些粒子与光一样具有不连续的量子化的能量。 分子的能量主要来自电子运动、分子或原子间的相对振动和分子围绕其质量中心的转动。,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,能级跃迁,原子（分子）能量高低用能级表示。最低的能级状态称“基态”，较高的状态称“激发态”。 可吸收外界一能量或放出自身的一能量而改变其能级。 从原有的能级改变为新的能级称为“跃迁”。能级跃迁所吸收或放出的能量可以是辐射能（光的形式），也可以是其它形式（如热能）。,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,光与物质间的能量交换,A、能级具不连续性，只吸收或释放出与两个能级差相同或为其倍数的能量。能量交换时，物质只吸收或发射一定频率（或波长）的光，即吸收（发射）具有选择性。 E = E高 E低 = E光子 = h= hc/ B、 一种物质具有多种能级态，可有大小不同的各种能级差，故能同时吸收或发射多种不同频率或波长的光。各能级间发生跃迁的几率不同，在宏观上则表现出所吸收或发射的各种光有强弱之别。 以上两点是光谱形成的基础,9月14日2005年,9月14日2005年,光谱及其分类,光谱 以光的波长或波数为横坐标，物质对不同波长光的吸收或发射强度为纵坐标所描的图象即为光谱。,9月14日2005年,9月14日2005年,四种苯丙胺类毒品的紫外吸收光谱图 上左：MA；上右：DOM；下左：MDA；下右：MDMA,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,分光光度法,光谱法 利用光谱各种特征进行分析的方法。在一定条件下，光谱是物质特性之一，常用于定性分析。 光度法 以物质量与吸收或发射的光强度间的关系为基础的方法。在一定条件下，物质的量与吸收或发射的光强度之间存在着固定的函数关系，被用于定量分析。 分光光度法 光谱法与光度法不能截然分开，故两者又通称为“分光光度法”.,9月14日2005年,9月14日2005年,紫外 - 可见分光光度法（UV - VIS spectrophotometry ，UV）,利用分子化合物吸收紫外或可见光（200 800）时所产生的分子吸收光谱进行定性和定量的方法。 一般简称紫外分光光度法，是药毒物分析中应用较广的一种分光光度法。,9月14日2005年,9月14日2005年,紫外吸收光谱,吸收光谱定性鉴别依据 以200 800 nm近紫外光和可见光的波长作为横坐标，以化合物对紫外可见光的吸收程度作为纵坐标所描绘的曲线。所以，紫外吸收光谱也称“紫外吸收曲线”。 波长为200 800 nm 的光，其能量大小所相当的能级跃迁，主要为分子外层的电子跃迁，因此紫外吸收光谱又称“电子光谱”。,9月14日2005年,9月14日2005年,紫外 - 可见分光光度法,吸收带 发生电子跃迁时，常同时伴有振动和转动，使得分子吸收的不是一个值，而是以电子跃迁所需能量为主的范围值。 也即不是一个波长的光，而是以某一波长为主的一段波长范围内的光，形成一个吸收带，属于“带状光谱”。 实际上是由许多波长非常接近的线状光谱聚集而成。在描绘曲线时，一般仅将每条线状光谱的最大值连接，形成一条曲线，即吸收曲线。,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,吸收曲线特征,一般一种化合物的吸收曲线上可有 “最大吸收波长（max）” “最小吸收波长（mix） ” “肩峰（sh）” “末端吸收（ed）”,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,吸收定律（Beer-Lambert定律）,定量依据 Beer-Lambert定律是分光光度法的基本定律，它说明吸光物质对单色光的吸收强度与吸光物质溶液的浓度和厚度之间的关系。厚度一定的情况下，说明吸收强度与溶液浓度间的关系，称Beer定律。,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,透光率 (transmitance) T = P / P0 = 10-abc 吸收度(absorbance) A = -lgT = -lg ( P / P0 ) = abc,9月14日2005年,9月14日2005年,吸收系数(absorptivity),吸收定律中的比例常数a称“吸收系数”,又称“吸光系数”或“消光系数” 其意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸收度 在一定的条件下(如单色光波长、溶剂、厚度等)下，吸收系数是物质的特性常数。,9月14日2005年,9月14日2005年,不同化合物对同一波长的单色光，可有不同的吸收系数；一种化合物对不同波长的单色光可有不同的吸收系数，因此而形成曲线。吸收系数和吸收曲线的不同是定性鉴别的依据。,9月14日2005年,9月14日2005年,在Beer定律中，吸收系数是吸收度与浓度直线关系中的斜率，是定量参数。其值越大，直线越陡，检测灵敏度就越高。 A = abc 吸收系数有百分吸收系数(E1%1cm)和摩尔吸收系数()两种，前者常用于含量测定，后者多用于分子结构研究。,9月14日2005年,9月14日2005年,吸收度的加和性,Beer-Lambert一般指溶液中只有一种吸光物质 如果有两种以上吸光物质时，只要物质间不发生化学反应，互不影响性质，吸收定律仍可适用。但此时测得的吸收度为所有物质吸收度的总和，即 A = A1 + A2 + A3 + = a1c1 + a2c2 + a3c3 + ,9月14日2005年,9月14日2005年,测得的吸收曲线是各种吸光物质的吸收曲线叠加的。 吸收度的加和性是测定混合组分的依据。 从另一角度讲，也给未知物的定性分析以及复杂组成检材的含量测定带来很大的麻烦。,9月14日2005年,9月14日2005年,影响测定的因素,A .化学因素 * 浓度 只适用于一定浓度范围的情况，溶液浓度太低或太高时，解离、缔合等可使一些物质的浓度和吸光性质发生变化，浓度与吸收度之间的关系偏离Beer定律。 * 酸碱性 具有电解质性质的化合物，在不同pH溶液中所存在的化学状态不同，吸光性质也常不同。有些药毒物具有弱电解质的性质，溶液pH的变化常可改变其吸收光谱的形状和吸收峰位。 * 溶剂 有些化合物可与某些溶剂化合，因此而改变其吸光性质。,9月14日2005年,9月14日2005年,B. 单色光纯度 吸收定律只有在照射光为单色光的条件下才成立，单色光越纯，吸收定律越准。 * 谱带宽(bandwidth) 谱带过宽一方面使测得值不准，另一方面使尖峰变坦。 * 杂散光(stray light) 多因光学元件污染或霉蚀产生的距测定波长较远的光。杂散光多或很强时，也可使光谱变形。在短波区常使光谱出现假峰。溶剂吸收强时，杂散光的影响犹为明显。,影响测定的因素,9月14日2005年,9月14日2005年,C. 反射与散射 * 测定光路中，由于溶液及容器的截面反射和溶液中质点对光的散射作用，可使光强减弱。溶液中质点的分子越大或照射光的波长越短，散射就越强。一般情况下，反射和散射可用空白抵偿，有时也会因不能抵偿而引入误差。,影响测定的因素,9月14日2005年,9月14日2005年,仪 器,紫外可见分光光度计是用于测定紫外光谱和进行光度法测定的专门仪器。不同厂家部分组成不同型号的仪器，虽光路和结构有所不同，但基本都由以下几。,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,9月14日2005年,Design of DAD,感谢安捷伦公司提供此图片,9月14日2005年,9月14日2005年,应用意义,A应用的广泛性 * 优点 测定时不破坏样品。 绝大部分药毒物具有紫外吸收。 样品溶液浓度与吸收度间有良好的计量关系。 有较高的灵敏度， * 应用定性分析中广泛用于预试、筛选和鉴别。 常用于定量。,9月14日2005年,9月14日2005年,B、应用的局限性 * 缺点 光谱特征信息量少 不具备分离能力 * 应用宽谱带光谱，光谱特征局限性，定性能力较弱。 杂质干扰大，成分复杂的检材应用受限。,9月14日2005年,9月14日2005年,Diode-array detector or Multiple wavelength,Isocratic pump,Binary pump,Quaternary pump,Variable wave- length detector,Vacuum degasser,Thermostatted column compartment,Autosampler (optionally cooled),Fluorescence detector or Refractive Index,Manual injector,1100 HPLC Modules,Mass-spec Detector,Capillary Pump,Prep pump,well plates Autosampler,感谢安捷伦公司提供此图片,9月14日2005年,9月14日2005年,荧光分光光度法,利用分子在紫外可见区产生的荧光光谱进行定性定量分析。 A、原理 * 荧光是一种以光为激发源的发光现象。当以一定波长的光照射某些物质时，分子可因吸收照射光能量而从基态跃迁到激发态。处于激发态的分子很不稳定，在极短的时间内又跃回基态，并同时以发射光的形式放出能量，所发射的光就称“荧光”。一般来讲，荧光的能量较原激发光的能量小。,9月14日2005年,9月14日2005年,荧光光谱,一种化合物所能接受的激发光和发射的荧光是具有选择性的。能同时吸收多种波长的激发光和发射多种波长的光。,9月14日2005年,9月14日2005年,荧光光谱,以某一波长的光作为激发光，以分子产生的荧光波长作为横坐标，荧光强度作为纵坐标所描绘的曲线就称“荧光光谱”。 荧光光谱属于发射光谱。能被分子吸收的光都能用作荧光的激发光源，不同波长的激发光可改变荧光的强度，但对荧光光谱的形状和位置影响较小。,9月14日2005年,9月14日2005年,激发光谱,如果固定所检测的荧光波长，依次改变激发光的波长，测定不同激发光所产生的荧光强度，并以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标所描绘的曲线称“激发光谱”。实际上激发光谱反映的就是紫外光谱。可用于选择激发光波长。,9月14日2005年,9月14日2005年,荧光分光光度法,B、特点 * 灵敏度高，可达10-9。 * 属宽谱带光谱，信息量少，特征性较差。 * 无分离能力，干扰大。,9月14日2005年,9月14日2005年,应用,* 一般有紫外吸收的化合物不一定能产生荧光，但产生荧光的必须有紫外吸收。能产生荧光的药毒物，可利用其荧光光谱和激发光谱进行定性鉴别；也可利用荧光强度与溶液浓度的关系进行含量测定。 * 因干扰大，在毒物分析中单独应用的情况较少，可与其他方法联用。,9月14日2005年,9月14日2005年,原子吸收分光光度法(Atomic Absorption Spectrophotometry),以原子吸收光谱为基础进行定性定量的分析方法。 A、 原理 原子吸收紫外可见区一定波长的光能后，由基态跃迁到激发态形成原子吸收光谱。由于原子能级跃迁只是单纯的电子跃迁，没有振动和转动能级，因此与分子的吸收光谱相比，原子吸收光谱更简单，属于线状光谱。光谱中的谱线，称“共振线”，是原子发生能级跃迁时吸收特定波长光产生的光谱。,9月14日2005年,9月14日2005年,B、特点 * 优点 灵敏度高，10-10 10-14。 准确度高。 光谱特征性强。 杂质干扰小。 应用较广。 * 缺点 对化合物来讲，只能测出所含的某种元素，不能反映化合物的结构和化合状态。,9月14日2005年,9月14日2005年,红外光谱法(Infrared Spectrum),物质吸收4000 400cm-1区域红外光发生能级跃迁所形成的吸收光谱。 A、是以分子的振动能级跃迁为主的吸收光谱。因振动能级跃迁的同时也伴有分子转动能级，所以红外光谱也称“振动光谱”或“转动光谱”。红外光谱也属于带状光谱，但比紫外光谱的带窄得多。,9月14日2005年,9月14日2005年,B、 特点 * 优点 定性鉴别力强，有指纹识别意义。 可应用的化合物广（包括所有有机物和部分无机物）。 * 缺点 灵敏度较低，一般mg级。 无分离能力，杂质干扰的大。,9月14日2005年,9月14日2005年,海洛因的红外吸收光谱图,波数/cm-1,9月14日2005年,9月14日2005年,戊巴比妥与异戊巴比妥的红外光谱图 上：戊巴比妥； 下：异戊巴比妥,9月14日2005年,9月14日2005年,