发酵液的预处理及回收

第二章 发酵液的预处理和菌体的回收,固体颗粒沉降速度,与固液分离相关的微生物发酵液特性： 发酵产物浓度较低，大多为110，悬浮液中大部分是水，处理体积量大； 各类细胞的颗粒小，相对密度与液相相差不大； 细胞含水量大，可压缩性大，一经压缩就会变形； 流变特性复杂，液相粘度大，吸附在滤布上； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。 动植物细胞没有微生物细胞耐剪切，不适于离心。 因此，这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难。,工业技术中典型的固体粒子,发酵液的预处理,发酵液的预处理目的和内容： 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率； 分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。 发酵液的预处理主要包括： 发酵液过滤特性的改变； 相对纯化。,滤饼的过滤速率,（一）发酵液过滤特性的改变 目的：通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能，降低滤饼阻力，提高过滤与分离的速率。 方法：调酸(等电点)、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻解冻及添加助滤剂等。,滤饼的过滤速率,1 降低液体粘度 加水稀释法：能降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下降50以上才能有效提高过滤速率。 升高温度：可有效降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。 注意事项：严格控制加热温度与时间。首先，加热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。,2 调整pH pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。 如利用酸碱性来调液pH值使蛋白质等两性物质达到等电点得以除去。又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。,细 胞 组 成,3 凝聚与絮凝 采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。除此之外，还能有效地除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质量。因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用的预处理方法之一。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。,凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（1mm左右）的现象。 Al3+Fe 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li + 。 常用的凝聚电解质有硫酸铝(明矾)、氯化铝、三氯化铁、硫酸亚铁、石灰、硫酸锌、碳酸镁等。,胶体双电层的构造,絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成粗大的絮凝团（10mm）的过程。絮凝是一种以物理的集合为主的过程。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，这些基团通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。,絮凝剂的化学结构,1. 要求其分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合； 2. 具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团， 3. 相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。,根据其活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类： (1)有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙类衍生物。 (2)无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等。 (3)天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,絮凝剂的分类,絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。,影响絮凝效果的因素,带负电荷的菌体 或蛋白质,阳离子型高分子絮凝剂,非离子型和 阴离子型高分子絮凝剂,电解质,非离子型和 阴离子型高分子絮凝剂,+,?,?,?,包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,4 加入助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增大。 常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。 助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时兼用。,助滤剂使用要点,根据目的产物选择助滤剂品种 根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种 粒度选择 使用量选择,5 加入反应剂 利用反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀。 作用：生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而改善过滤性能。 举例：如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠。 环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀。,（二）发酵液的相对纯化 高价无机离子的存在： 影响树脂对生化物质的交换容量。 可溶性蛋白质的存在： 降低离子交换和吸附法提取时交换容量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清；在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤速率。,1 高价无机离子的除去 去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵，注意回收。 去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。 用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。 去除铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。,2 杂蛋白质的除去 (1) 沉淀法 蛋白质在酸性溶液中，能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、 Cu2+ 、 Zn 2+、Fe 3+ 和Pb2+等形成沉淀。 (2) 吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而可加快过滤速率。,(3)变性法 加热，大幅度调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等。 例如：在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH2 3) 或较碱性范围(pH89)使蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。 变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,二、固液分离 发酵液固液分离的主要是离心分离和过滤。 不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法 霉菌和放线菌发酵液：过滤方法 细菌和酵母菌发酵液（未经预处理）：高速离心。 细菌和酵母菌发酵液（进行预处理）：过滤方法。 举例：如菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处理后，即可用板框过滤机或带式过滤机进行菌体分离,（一）离心分离 离心分离是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩的分离的过程。 特点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等优点。 缺点：设备投资高、能耗大，此外连续排料时，固相干度不如过滤设备。,碟片式离心机,按卸料方式的不同，碟片式离心机分为: 人工卸料 自动间歇排料 喷嘴连续排料 特点：前两种适合于悬浮液固形颗粒含量较少的场合。间歇式操作，固相干度较好；而连续操作固相含液量较大，其固相仍具有流动性。,适用范围,碟片式离心机适应于细菌、酵母菌、放线菌等多种微生物细胞悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。 它的生产能力较大，最大允许处理量达300m3h，一般用于大规模的分离过程。,管式离心机,管式离心机也是一种沉降式离心机，可用于液液分离和固液分离。当用于液液分离时为连续操作，而用于固液分离时则为间歇操作，操作一段时间后需将沉积于转鼓壁上的固体定期人工卸除。,管式离心机的转鼓直径较小，容量有限，因此生产能力较小。转速相对较低的管式离心机最大处理量可达10m3h。 管式离心机除可用于微生物细胞的分离外，还可用于细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。 管式离心机设备简单，操作稳定，分离效率高。在生物工业中，特别适合于一般离心机难以分离而固形物含量1的发酵液的分离。对于固形物含量较高的发酵液，由于不能进行连续分离，需频繁拆机卸料，影响生产能力，且易损坏机件。,倾析式离心机 靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣，因而也称为螺旋卸料沉降离心机。倾析式离心机的转动部分由转鼓及装在转鼓中的螺旋输送器组成，两者以稍有差别的转速同向旋转。在离心力作用下，固体颗粒发生沉降分离，沉积在转鼓内壁上。堆积在转鼓内壁上的固相靠螺旋推向转鼓的锥形部分，从排渣口排出。,优点：具有操作连续、适应性强、应用范围广、结构紧凑和维修方便等优点，特别适合于含固形物较多的悬浮液的分离。 缺点：这种离心机的分离效果较差，因而不适合于细菌、酵母菌等微小微生物悬浮液的分离。此外，液相的澄清度也相对较差。,常用离心机的特性及选用,（二）过滤 根据过滤机理的不同，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤两种。 澄清过滤:将过滤介质填充于过滤器内构成过滤层，当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，这种方法叫做澄清过滤。 过滤介质：硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层。 适合于固体含量少于0.1gl00ml、颗粒直径在5100m的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。,滤饼过滤：过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布，及毡、石棉板、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布所阻拦而逐渐形成滤饼(或称滤渣)。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤或滤渣过滤。 此种方法适合于固体含量 0.1g100ml的悬浮液的过滤分离。 滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。,板框过滤机是一种传统的过滤设备，在发酵工业中广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。,板框过滤机,特点： 优点：结构简单，装配紧凑，过滤面积大；过滤的推动力(压力差)能大幅度调整，并能耐受较高的压力差，因而固相含水分低，并能适应不同过滤特性的发酵液的过滤；辅助设备少、维修方便、价格低和动力消耗少等。 缺点：设备笨重、间歇操作、劳动强度大、卫生条件差、辅助时间多和生产效率低。 板框过滤机比较适合于固体含量110的悬浮液的分离。,特点： 自动化程度高、操作连续和处理量大适合于固体含量较大(10)的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母菌发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。 由于受推动力(真空度)的限制，真空转鼓过滤机一般不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤。此外，采用真空转鼓过滤机过滤所得固相的干度不如加压过滤。,真空转鼓过滤机,又称错流过滤、交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼)移走。当移走固体的速率与固体的沉积速率相等时，过滤速滤就近似恒定。,切向流过滤,这种方式目前仅用于实验室规模，处理量较少。 它的特点是灵活、操作方便; 可以维持较高的过滤速率。 目前切向流过滤的缺点还有： 过滤面积小，剪切力不均匀。 能耗比一般过滤高，大部分用来使流体产生快速流动。 固相的含水量较高，主要是起浓缩作用。当固相浓度较高而使流动性能下降时，过滤速率迅速下降。 不能避免过滤介质的污染和堵塞。,其它分离方法： 4 双水相萃取 5 吸附法,