【教学课件】第十二章免疫检测原理及方法

第十二章第十二章 免疫检测原理及方法免疫检测原理及方法第十二章第十二章 免疫检测原理及方法免疫检测原理及方法免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其重要的意义。免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反应有高度特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这方面的优势。第一节第一节 抗原或抗体的体外检测抗原或抗体的体外检测抗原与相应抗体在体外可以发生特异性结合，由于抗原的物理性状及参加反应其他辅助物质的不同，抗原和抗体结合后可出现凝集、沉淀、补体结合等反应。对这些现象进行分析、观察，可鉴定抗原或抗体。用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。由于试验时要用血清作为试验材料，所以这种抗原抗体的试验方法常称为血清学反应或血清学试验。现在由于抗体纯化技术及单克隆抗体技术的建立与应用，抗体不一定都来自血清，血清学试验一词的应用范围已不如以往普遍了。一、抗原一、抗原抗体反应总论抗体反应总论(一一)抗原一抗体反应的特点抗原一抗体反应的特点 1.高度特异性 2.表面的结合 3.一定比例范围内结合 4.结合反应分两个阶段(二二)影响抗原一抗体反应的因素影响抗原一抗体反应的因素 1.电解质 2.温度 3.pH值二、抗原二、抗原-抗体反应的基本类型抗体反应的基本类型由于新技术不断出现，抗原-抗体反应种类繁多。尽管如此，基本类型主要还是凝集反应、沉淀反应、浊度反应、补体介导反应和中和反应。上述反应的抗原特点、抗体名称、辅助条件、表现形式以及方法的敏感度各不相同。近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其他生物学许多领域中。二、抗原二、抗原-抗体反应的基本类型抗体反应的基本类型(一一)凝集反应凝集反应 1.直接凝集反应玻片法、试管法 2.间接凝集反应 3.补体结合反应(二二)沉淀反应沉淀反应 1.琼脂扩散试验 2.絮状沉淀法 3.环状试验(三三)免疫比浊法免疫比浊法 (四四)血清补体（血清补体（CH50CH50）的测定）的测定双向扩散双向扩散单向扩散单向扩散免疫电泳免疫电泳火箭电泳火箭电泳对流免疫电泳对流免疫电泳(五五)免疫标记技术免疫标记技术1.1.免疫荧光法免疫荧光法 荧光素结合到抗体分子上，用荧光标记抗体浸染可能含抗原的细胞或组织切片，在荧光显微镜下可见发荧光物体，以此对标本中相应抗原进行鉴定和定位。(1)定性法直接法、间接法、补体法 (2)定量法显微荧光光度计、流式细胞仪2.2.免疫酶标记法免疫酶标记法 用酶标记抗体(或抗原)，用酶的底物来显示抗原抗体反应，这种方法具有操作简便、安全，等特点。(1)ELISA直接法、简接法、夹心法、竞争法 (2)酶联免疫电泳转移印迹法(Westerb-Blot)(3)斑点免疫结合试验(Dot-ELISA)3.3.放射免疫测定法放射免疫测定法 原理是待测抗原和标记抗原与定量的相应抗体发生竞争性结合。待测抗原是动物内的某种微量活性物质，如细菌和寄生虫的可溶性抗原、激素类、细胞内信使如cAMP、cGMP和前列腺素E等。标记抗原是将已知的上述物质标记上放射性同位素(125I、131I 3H、4C、32P)。将标记抗原(Ag)和未标记抗原(Ag)按比例混合，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即竞争抑制反应。第二节第二节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞，执行细胞免疫的T细胞和沟通体液免疫和细胞免疫的其他细胞等。T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的T细胞、B细胞及其功能。一、免疫细胞的定量检测一、免疫细胞的定量检测(一一)T)T细胞的定量检测细胞的定量检测 检测T细胞数量最早和最普及的试验是红细胞花环试验，按花环阳性淋巴细胞百分率表示。目前，可通过检测T细胞表面CD抗原，了解外周血T细胞数量或亚群的变化。从外周血分离出富含的单个核细胞制合成适当数量的细胞悬液，分放在3个小试管中，分别用抗CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作为第一抗体进行结合，再用FITC标记的兔小鼠IgG抗体作为第二抗体进行间接免疫荧光染色。可在荧光显微镜下或用流式细胞仪观察结果。(二二)B)B细胞数量的检测细胞数量的检测B细胞表面有多种标志，如SmIg、IgG的Fc受体、补体受体等。通过检测SmIg，了解成熟B细胞的数量，将单个核细胞用FITC标记的兔抗免疫球蛋白作直接免疫荧光染色，显荧光的细胞为SmIg+细胞，即B细胞。溶血空斑试验是体外检测抗体形成细胞的一种方法，即将经红细胞(RBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的RBC结合，于37作用下，免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的RBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。三、淋巴细胞转化试验三、淋巴细胞转化试验当机体受到抗原(或丝裂原)的刺激时，T淋巴细胞就可以转化为淋巴母细胞，进一步转化为致敏淋巴细胞。这种转化在一定的程度上代表着机体的细胞免疫功能状态。这种转化也可在体外的T细胞的培养过程中加入适当的刺激原而出现，并表现出形态上的变化。主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算淋巴细胞转化率；另一种是同位素标记物掺入法，即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。细胞毒性T细胞试验(Cytotoxic T lymphocyte test，CTL test)的基本原理是将靶细胞，如肿瘤细胞、病毒转化细胞等，与同种抗原致敏的淋巴细胞混合培养，然后检测靶细胞的死亡情况。细胞毒性T细胞试验一下两种方法：(1)形态学检查法：根据体外贴壁生长的靶细胞被CTL杀伤后失去贴壁的能力，所以从贴壁细胞数目减少情况可判断CTL杀靶细胞的能力。(2)51Cr释放法：用铬酸钠(Na51CrO4)标记的靶细胞与致敏淋巴细胞一起培养，靶细胞被CTL杀灭后，51Cr即释放到培养液中，测定释放到培养液中51Cr的脉冲数(cpm)即反映出CTL杀靶细胞的程度。四、细胞毒性细胞杀伤靶细胞的检测四、细胞毒性细胞杀伤靶细胞的检测第三节第三节 细胞因子的检测细胞因子的检测细胞因子检测包括生物学、免疫学和分子生物学测定三大类方法。1.生物学测定法，包括有3H-TdR掺入法、微量酶检测法和细胞计数法。用生物学方法测定细胞因子，使用最早，也最普及。2.免疫学测定法,包括免疫斑点法、ELISA、RIA和免疫印迹法等，优点是特异性和重复性较好，快速简便。3.分子生物学测定法,有RNA印迹怯、核酸酶保护分析、原位杂交和PCR等。该法敏感性高，可先于生物学和免疫学方法预知细胞的分泌情况。