第七章抗原抗体反应

12 ppt课件制作及讲课课件制作及讲课 n原则原则 自愿自愿 有兴趣有兴趣n组织方式组织方式 分组讲分组讲 选出最好在班上讲选出最好在班上讲n内容内容 自选自选n数量数量 15张张n分别折算分别折算 1 2 3次作业次作业3上章小结：上章小结：一基本概念一基本概念 主要组织相容性复合物等主要组织相容性复合物等二二MHCMHC抗原的结构和功能抗原的结构和功能 MHC-I MHC-IIMHC-I MHC-II结构、功能及两者与肽结合的区别结构、功能及两者与肽结合的区别三三MHCMHC抗原基因多态性及结构抗原基因多态性及结构四四MHCMHC的检测原理的检测原理和应用和应用4一节一节抗体的制备抗体的制备二二节节抗原抗体反应抗原抗体反应三三节节抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用5一抗血清的制备及抗体纯化一抗血清的制备及抗体纯化二单克隆抗体的制备二单克隆抗体的制备三三 抗体工程抗体工程四四 催化性抗体催化性抗体五五 抗体在抗肿瘤治疗中的应用抗体在抗肿瘤治疗中的应用继续继续6 一抗血清的制备及抗体纯化一抗血清的制备及抗体纯化 1 1、抗血清的制备、抗血清的制备 抗血清：抗血清：含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。抗血清的纯化抗血清的纯化 见下图见下图免疫动物免疫动物 抗原抗原(半抗原需经转化半抗原需经转化)佐剂乳化佐剂乳化 免疫动物免疫动物抗血清的制备抗血清的制备 抗血清的效价测定抗血清的效价测定采血采血 获得抗血清获得抗血清7抗血清抗血清+3+3倍体积倍体积0ddH0ddH2 2O,O,调调pHpH到到7.77.7加加50%-2050%-20酒精酒精至最后质量分数为至最后质量分数为20%(20%(保持保持-5)-5)上清上清沉淀沉淀(含含IgG/IgA/IgM/IgG/IgA/IgM/杂蛋白杂蛋白)悬浮于悬浮于0.015-0.02mol/L0.015-0.02mol/L冷冷NaCl,NaCl,用用0.05mol/L0.05mol/L醋酸调醋酸调pHpH至至5(0)5(0)上清液上清液沉淀沉淀(含含IgA/IgM/IgA/IgM/杂蛋白杂蛋白)用用0.5mol/LNaH0.5mol/LNaH2 2POPO4 4调至调至pH7.4,-pH7.4,-2020至至-3095%-3095%酒精至最后质量分酒精至最后质量分数为数为25%25%，维持在，维持在-6-6 上清上清沉淀沉淀(IgG)(IgG)悬浮于悬浮于ddHddH2 2O,O,用用0.05mol/L0.05mol/L醋醋酸调至酸调至pH5.1pH5.1上清液上清液沉淀沉淀调调pHpH至至5.5,5.5,离子强度为离子强度为0.010.010.0075,0.0075,加加50%50%冷酒精至最后质量分数为冷酒精至最后质量分数为10%(-3)10%(-3)沉淀沉淀(IgA/IgM)(IgA/IgM)上清上清通过分子筛将二者分开通过分子筛将二者分开2 2、抗体、抗体初步纯化初步纯化8 抗血清的初步纯化只是多数抗体抗血清的初步纯化只是多数抗体类别类别的纯化。的纯化。上述冷酒精沉淀法上述冷酒精沉淀法是是19461946年年CohnCohn创立的较好方法。创立的较好方法。该法得到的只是较粗该法得到的只是较粗IgIg。硫酸铵盐析法：硫酸铵盐析法：比较简便，蛋白质变性小，比较简便，蛋白质变性小，33%33%饱和饱和硫盐沉淀各类硫盐沉淀各类IgIg，分离纯度较差。浓盐使，分离纯度较差。浓盐使IgAIgA形成二聚体，形成二聚体，不宜采用。不宜采用。离子交换层析法：离子交换层析法：通过层析法，才能获得高纯度某通过层析法，才能获得高纯度某一类一类IgIg。93 3、抗体进一步纯化、抗体进一步纯化 IgGIgG在血清中含量最高，占在血清中含量最高，占757580%80%，纯化的方法常用，纯化的方法常用33-50%33-50%硫铵盐析和硫铵盐析和DEAE-DEAE-纤维素纤维素柱层析法。柱层析法。IgGIgG在在pH7.5pH7.5溶液中带正电荷，其它血清蛋白都带负电溶液中带正电荷，其它血清蛋白都带负电荷，因此可用阴离子交换剂荷，因此可用阴离子交换剂DEAE-DEAE-纤维素一次将纤维素一次将IgGIgG提纯到提纯到很高的纯度。很高的纯度。分离纯化分离纯化IgMIgM常用常用18%18%硫铵沉淀，再硫铵沉淀，再DEAE-DEAE-纤维素柱层纤维素柱层析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的IgMIgM。获得的纯化获得的纯化IgIg，在，在44保存，长期保存需在保存，长期保存需在-20-20以下。以下。10 问题：问题：血清中的抗体是由多个抗原决血清中的抗体是由多个抗原决定簇刺激定簇刺激B B细胞克隆而产生的抗体，是多克细胞克隆而产生的抗体，是多克隆抗体隆抗体(PAb(PAb)，通过分离的方法不可能获得真，通过分离的方法不可能获得真正的单一抗体。正的单一抗体。如何获得大量的一种抗体？如何获得大量的一种抗体？由单一由单一B B细胞克隆而产生的抗体，称单细胞克隆而产生的抗体，称单克隆抗体克隆抗体(MAb(MAb)。二单克隆抗体的制备二单克隆抗体的制备11 1 1 、制备、制备MAbMAb(monoclonal Ab,mAb)的原理的原理 利用利用B B细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产，称为杂交瘤技术产，称为杂交瘤技术。该技术是该技术是19751975年由年由G.KhlerG.Khler&Milstein&Milstein创立的。创立的。122 2、制备、制备MAbMAb的基本过程的基本过程免疫小鼠免疫小鼠品种、加强品种、加强3d3d脾脏脾脏单细胞悬浮单细胞悬浮洗掉血清洗掉血清骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞营养缺陷型营养缺陷型PEGPEGHATHAT培养基培养基37375%CO5%CO2 2选抗体选抗体分泌株分泌株克 隆 阳 性 细克 隆 阳 性 细胞胞,1,1细胞细胞/孔孔增殖阳增殖阳性克隆性克隆-70-70或液氮或液氮冻存冻存细胞细胞腹水制备腹水制备扩大培养扩大培养中空纤维反应器中空纤维反应器继续继续13返返 Procedures for Producing Hybridomas and Monoclonal Antibodies14q用于制备用于制备B B细胞的小鼠常用细胞的小鼠常用Balb/cBalb/c品系，为品系，为H-2dH-2d单元单元(倍倍)型。型。qB B细胞从小鼠的脾脏制取。细胞从小鼠的脾脏制取。为保证为保证B B细胞有旺盛的分泌抗体活性，分离前细胞有旺盛的分泌抗体活性，分离前3 3天一次静脉加强免疫。天一次静脉加强免疫。B B细胞要悬浮于没有血清的培养液。细胞要悬浮于没有血清的培养液。骨髓瘤细胞有多种细胞株，骨髓瘤细胞有多种细胞株，营养缺陷型营养缺陷型是一种。是一种。缺陷是细胞缺少次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷酸缺陷是细胞缺少次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷酸转移酶转移酶(HGPRT)(HGPRT)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶激酶激酶(TK)(TK)，另一条核酸合成必须酶。当合成核酸的正常途径被阻断后，另一条核酸合成必须酶。当合成核酸的正常途径被阻断后（培（培养基中加入氨基喋呤），养基中加入氨基喋呤），虽然培养基中有这二种底物虽然培养基中有这二种底物(次黄嘌呤、胸腺嘧啶次黄嘌呤、胸腺嘧啶)，但缺陷细胞仍不能合成核酸而死亡。但缺陷细胞仍不能合成核酸而死亡。如果骨髓瘤细胞与如果骨髓瘤细胞与B B细胞发生了融合，因细胞发生了融合，因B B细胞有正常的细胞有正常的2 2套核酸合成套核酸合成酶系，正常途径受阻后，能利用培养基中的次黄嘌呤酶系，正常途径受阻后，能利用培养基中的次黄嘌呤(H)(H)、胸腺嘧啶、胸腺嘧啶(T)(T)来合成核酸，因此融合后的杂交瘤细胞能在选择培养基中正常分裂生长。来合成核酸，因此融合后的杂交瘤细胞能在选择培养基中正常分裂生长。骨髓瘤细胞还应该具有不能合成抗体或合成了也不能分泌的特性骨髓瘤细胞还应该具有不能合成抗体或合成了也不能分泌的特性q融合时，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，融合时，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，B B细胞有旺盛的分泌抗体活性。细胞有旺盛的分泌抗体活性。融合细胞按融合细胞按B B细胞：骨髓瘤细胞细胞：骨髓瘤细胞5 51010：1 1，总细胞数在，总细胞数在10107 7-10-108 8水平。水平。加入融合剂：加入融合剂：50%50%的聚乙二醇的聚乙二醇(PEG)(PEG)，3737下融合下融合1 12min2min。然后用培养液然后用培养液RMPI1640RMPI1640进行洗涤稀释，去除进行洗涤稀释，去除PEGPEG后，于后，于HATHAT培养基上培养培养基上培养.15 筛选抗体分泌株：筛选抗体分泌株：是将对是将对HATHAT上形成的杂交瘤细胞集落进行上形成的杂交瘤细胞集落进行抗体活性检测。抗体活性检测。单克隆化：单克隆化：将多种细胞混合生长的细胞团分离为单克隆，将多种细胞混合生长的细胞团分离为单克隆，HAT:HAT:即含有次黄嘌呤即含有次黄嘌呤(H)(H)、氨基喋呤、氨基喋呤(A)(A)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶(T)(T)的的选择培养基，简称选择培养基，简称HATHAT。这种培养基能使杂交瘤细胞生长，而营养缺陷型的骨髓这种培养基能使杂交瘤细胞生长，而营养缺陷型的骨髓瘤细胞不能生长，瘤细胞不能生长，B B细胞因本身在培养基中不能生存。这样细胞因本身在培养基中不能生存。这样就能容易地将已经发生了融合的杂交瘤细胞筛选出来，其它就能容易地将已经发生了融合的杂交瘤细胞筛选出来，其它细胞自然被淘汰。细胞自然被淘汰。返返1216三三 抗体工程抗体工程四四 催化性抗体催化性抗体五五 抗体在抗肿瘤治疗中的应用抗体在抗肿瘤治疗中的应用17二节二节抗原抗体反应抗原抗体反应 一、抗原抗体反应的特点一、抗原抗体反应的特点 抗原与抗体的抗原与抗体的特异性特异性结合结合,既可以发生在体内既可以发生在体内,也可也可发生在体外。发生在体外。发生在体外是许多免疫检测方法的基础。发生在体外是许多免疫检测方法的基础。抗原与抗体相互作用是抗原与抗体相互作用是非共价的、可逆的非共价的、可逆的,其特性其特性符合许多化学反应的基本原理符合许多化学反应的基本原理.18 特异性特异性 抗原与抗体相互结合没有共价键形成，只能抗原与抗体相互结合没有共价键形成，只能通过通过次级键次级键相互作用，在极短的距离内才有效，相互作用，在极短的距离内才有效，因此抗原决定簇和抗体结合位点在因此抗原决定簇和抗体结合位点在空间上必须处空间上必须处于紧密接触于紧密接触的状态，才能产生足够的结合力的状态，才能产生足够的结合力(亲和亲和力力)。这种分子间的互补结构决定了这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合抗原抗体结合的专一性。的专一性。19盐 键盐 键氢 键疏水相互作用疏水相互作用范德华力范德华力次级键有次级键有:氢键氢键 范德华力范德华力 疏水相互作用疏水相互作用 盐键等盐键等20 抗原抗体结合的可逆性抗原抗体结合的可逆性AgAbAgAbK1K221AbAgAgAbKKK抗原或半抗原与抗体之间的结合强弱称为抗原或半抗原与抗体之间的结合强弱称为亲和力亲和力.抗原抗体结合松散，易于解离，亲和力低，反之亲和力高。抗原抗体结合松散，易于解离，亲和力低，反之亲和力高。21Ag或或AbAg-Ab22 二二 抗体与单价抗原的作用抗体与单价抗原的作用 三三 抗体与大分子多价抗原反应抗体与大分子多价抗原反应 大分子多价抗原大分子多价抗原 具有多个抗原决定簇，能与多个抗体结合的大分子物质。具有多个抗原决定簇，能与多个抗体结合的大分子物质。抗原抗体的亲和力和亲合力抗原抗体的亲和力和亲合力 单价抗原与抗体的结合力，称亲和力。单价抗原与抗体的结合力，称亲和力。多价抗原与抗体的总结合强度，称亲合力。多价抗原与抗体的总结合强度，称亲合力。亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度的增加不仅仅亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度的增加不仅仅是亲和力的简单相加，是呈几何级数上升的。是亲和力的简单相加，是呈几何级数上升的。23 抗原抗体反应的表现抗原抗体反应的表现形成沉淀形成沉淀 与抗原抗体比例密切相关，一定浓度的抗体与一定浓与抗原抗体比例密切相关，一定浓度的抗体与一定浓度的抗原才能形成沉淀度的抗原才能形成沉淀.抗原或抗体过剩都不能形成沉淀或很少。抗原或抗体过剩都不能形成沉淀或很少。抗体过量抗体过量抗原抗体适量抗原抗体适量抗原过量抗原过量网络学说网络学说:认为抗原抗体的结合包括许多抗原抗体相互连接形认为抗原抗体的结合包括许多抗原抗体相互连接形成网络。多价的抗体与多价的抗原反应时，一个抗体可以结成网络。多价的抗体与多价的抗原反应时，一个抗体可以结合二个或以上相同抗原的决定簇，一个抗原也能与多个抗体合二个或以上相同抗原的决定簇，一个抗原也能与多个抗体结合，从而形成相互交联的网络，当这些聚合达到一定大小结合，从而形成相互交联的网络，当这些聚合达到一定大小时就会从溶液中沉淀出来。时就会从溶液中沉淀出来。24 交叉反应交叉反应 有几个决定簇的两个抗原，如果其中有一个决定簇有几个决定簇的两个抗原，如果其中有一个决定簇相同，那么免疫获得的抗体中就有能与两种抗原上相同相同，那么免疫获得的抗体中就有能与两种抗原上相同决定簇都能结合的一种抗体，即有交叉反应现象。如决定簇都能结合的一种抗体，即有交叉反应现象。如M M抗原和抗原和N N抗原抗原MACDBNFHJB25三抗原抗体反应的应用三抗原抗体反应的应用1 1免疫沉淀免疫沉淀2 2免疫标记免疫标记3 3免疫定位分析免疫定位分析26 1 1免疫沉淀免疫沉淀 由于抗体与相应的抗原两者之间有特异性结由于抗体与相应的抗原两者之间有特异性结合，在体外当两者浓度比例适当时，会发生免疫合，在体外当两者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀反应。沉淀反应。原理：原理：抗原抗体结合形成网络而沉淀抗原抗体结合形成网络而沉淀。应用：应用：抗原或抗体的定性及定量分析。抗原或抗体的定性及定量分析。方法：方法：溶液中的沉淀反应溶液中的沉淀反应 凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀 免疫电泳免疫电泳返返27 溶液中的溶液中的沉淀反应：沉淀反应：液相中的沉淀液相中的沉淀线不易观察，利用抗线不易观察，利用抗原抗体溶液之间的界面形成的沉淀线即环状沉淀试验。在几原抗体溶液之间的界面形成的沉淀线即环状沉淀试验。在几支支试管中加入等量的抗原，再加入递减量的抗体，中性、试管中加入等量的抗原，再加入递减量的抗体，中性、3737保温保温1 12hr2hr，可见，可见环状环状沉淀。沉淀。返返28 凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀 原理：原理：抗原抗体在半透明的半固相介质中自由扩散形成浓抗原抗体在半透明的半固相介质中自由扩散形成浓度梯度，两者在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。度梯度，两者在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。用途：用途：测定抗原和抗体的相对浓度，比较不同抗原的特异测定抗原和抗体的相对浓度，比较不同抗原的特异性纯度和相互关系。性纯度和相互关系。方法：方法：单向单向扩散法和扩散法和双向双向扩散法扩散法返返琼脂凝胶中混有Ab小孔中加有Ag沉淀环单向单向29左右二孔抗原浓度相同，沉淀线融合右孔抗原浓度较低，沉淀线细并靠近抗原孔右孔抗原甚微，近抗原孔处只有一弯眉双向：双向：不同抗原浓度对沉淀线特征的影响不同抗原浓度对沉淀线特征的影响继续30在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征(一一)在抗原孔内有三种在抗原孔内有三种抗原成分，分别与抗原成分，分别与相应抗体形成相应抗体形成3 3条沉条沉淀线。由于反应的淀线。由于反应的特异性，线互不干特异性，线互不干扰，线的顺序位置扰，线的顺序位置决定于抗原的性质决定于抗原的性质二孔内抗原成分性二孔内抗原成分性质完全不同，出现质完全不同，出现沉淀线交叉现象沉淀线交叉现象左孔内含二种抗原左孔内含二种抗原成分，其中一种与成分，其中一种与右孔内相同，出现右孔内相同，出现一条融合线一条融合线继续31左右二孔抗原性质左右二孔抗原性质相同，但右孔浓度相同，但右孔浓度过大，产生抗原抗过大，产生抗原抗体复合物逐渐溶解体复合物逐渐溶解的的“假刺假刺”现象现象在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征(二二)左右二孔抗原性质左右二孔抗原性质大部分相同，沉淀大部分相同，沉淀线融合较多线融合较多左右二孔抗原性质左右二孔抗原性质部分相同，出现部部分相同，出现部分融合现象分融合现象返返32抗血清抗血清电泳后在胶中间沿电泳方向开一条槽电泳后在胶中间沿电泳方向开一条槽 免疫电泳：免疫电泳：是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。继续继续33火箭电泳：单相免疫扩散与电泳结合的一种方法。火箭电泳：单相免疫扩散与电泳结合的一种方法。继续继续34双向免疫电泳双向免疫电泳返返35 2 2免疫标记免疫标记 放射免疫分析放射免疫分析 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）发光与荧光免疫分析发光与荧光免疫分析 亲和标记免疫分析亲和标记免疫分析返返36 放射免疫分析放射免疫分析 是用放射核素标记抗原是用放射核素标记抗原/抗体，通过放射自显影抗体，通过放射自显影(固相体固相体系系)或液相闪烁仪或液相闪烁仪(液相反应体系液相反应体系)来定量抗原来定量抗原/抗体。有：抗体。有：直接法：直接法：是用标记的抗原或抗体与抗体或抗原直接反应是用标记的抗原或抗体与抗体或抗原直接反应形成复合物而进行测定。形成复合物而进行测定。竞争法：竞争法：是利用放射标记的抗原与未标记的抗原竞争与是利用放射标记的抗原与未标记的抗原竞争与抗体反应，再以放射强度定量抗体反应，再以放射强度定量返返37 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）162162页页 是一种免疫酶技术，特点是利用聚苯乙烯是一种免疫酶技术，特点是利用聚苯乙烯微量反应板微量反应板(或球或球)吸附抗原吸附抗原/抗体，使之固相抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应在此进行。化，免疫反应和酶促反应在此进行。方法有：方法有：直接法、间接法、夹心法直接法、间接法、夹心法继续继续38酶联免疫吸酶联免疫吸附试验原理附试验原理返返39 发光与荧光免疫分析发光与荧光免疫分析 是利用化学发光物质如鲁米诺、呷啶酯等的氧化反应是利用化学发光物质如鲁米诺、呷啶酯等的氧化反应引起瞬间发光来测定。增强发光酶免疫分析是在酶促氧化引起瞬间发光来测定。增强发光酶免疫分析是在酶促氧化反应中加入增强剂，如荧光素、对反应中加入增强剂，如荧光素、对-碘酚、黄嘌呤氧化酶等，碘酚、黄嘌呤氧化酶等，这不仅可增强发光信号，且保持长时间的稳定发光。这不仅可增强发光信号，且保持长时间的稳定发光。返返40 亲和标记免疫分析亲和标记免疫分析 IgGIgG类抗体有一重要特性就是能和葡萄球菌类抗体有一重要特性就是能和葡萄球菌A A蛋白特异结合，而且亲和力很高，利用这一特点蛋白特异结合，而且亲和力很高，利用这一特点来对来对IgGIgG抗体标记，或用前述的酶、同位素、荧抗体标记，或用前述的酶、同位素、荧光素等标记光素等标记A A蛋白，再使其与蛋白，再使其与IgGIgG结合，这类结合，这类IgGIgG就带有标记，可进行前述的各种分析。就带有标记，可进行前述的各种分析。这里这里A A蛋白就相当于抗蛋白就相当于抗IgGIgG的抗体。的抗体。返返41 3 3免疫定位分析免疫定位分析 这种分析技术的基本原理与前述的这种分析技术的基本原理与前述的ELISAELISA、荧光免疫分析等相同，不同在于其分析的主要荧光免疫分析等相同，不同在于其分析的主要目的是定位而非定量，即可将细胞或分子在组目的是定位而非定量，即可将细胞或分子在组织或细胞内进行定位。同样有荧光定位和酶标织或细胞内进行定位。同样有荧光定位和酶标定位等方法，这里着重介绍一下蛋白印迹定位等方法，这里着重介绍一下蛋白印迹。42Western blotting assayPolymer sheet即高分子膜,如常用的硝酸纤维膜4344作业：作业：1.1.简述单克隆抗体的制备过程。简述单克隆抗体的制备过程。2.2.名词解释名词解释:免疫电泳免疫电泳 免疫沉淀免疫沉淀 ELISAELISA