氨基组成分析

第三章第三章 氨基酸组成分析氨基酸组成分析 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75200Da之间，其化学通式为之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体，在生物体内出现的氨基酸都是内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出型，仅在少数微生物来源的多肽中出现现D型氨基酸。型氨基酸。氨基酸分析技术的发展始于氨基酸分析技术的发展始于1820年，由年，由Braconnot最早最早将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用世纪，用化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数月的繁琐的工作。月的繁琐的工作。色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。1941年，年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年，年，Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是经典的方法。经典的方法。现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液在在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，一种可能是蛋白质的一种可能是蛋白质的N端封闭，端封闭，另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质物质，物质，解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品的成分的成分。除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。第二节 蛋白质的水解方法 氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用5.7mol/L盐酸在真空状况下于盐酸在真空状况下于110水解水解24h，也有在，也有在150下快速水下快速水解解90min。Waters公司有商品化仪器公司有商品化仪器(水解工作台水解工作台)出售。将出售。将100500mol的的蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入5.7mol/L盐酸盐酸200l，含，含2苯酚苯酚(m/V)，将指管置于反应器中，抽真，将指管置于反应器中，抽真空并充氮气反复三次空并充氮气反复三次(图图3.1c，真空控制也是实验重复性的一项重要因，真空控制也是实验重复性的一项重要因素素)110保温保温22h。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸和甲硫氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如ValVal，IleLeu等，水解时间可适当延长至等，水解时间可适当延长至72h，但长时间水解会，但长时间水解会部分破坏含羟基的氨基酸部分破坏含羟基的氨基酸丝氨酸丝氨酸(Ser)，苏氨酸，苏氨酸(Thr)，酪氨酸，酪氨酸(Tyr)。影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸、核糖核酸酶酶(RNase)或胰岛素或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色为标样进行水解、衍生和色谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价方法的适用性。方法的适用性。但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的氨基酸含量只有氨基酸含量只有12个，这影响到氨基酸的回收。生物应个，这影响到氨基酸的回收。生物应用公司（用公司（ABI）曾设计过一种）曾设计过一种“测试肽测试肽”，即人工合成，即人工合成18种种不不同氨基酸的肽同氨基酸的肽(除除Gln、Asn外外)，这样每种氨基酸出现的频，这样每种氨基酸出现的频率都是率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情况。况。第三节第三节 特殊氨基酸的保护和定量特殊氨基酸的保护和定量3碱碱 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸色氨酸不被破坏。不被破坏。4酶酶 蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法校正。校正。5光谱法光谱法 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其在在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.21时的情况。酪时的情况。酪氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。Hewlett Packard公司推出的公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件，检测器配合其化学工作站软件，能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两种，一种是还原烷化法，另一种是氧化法。种，一种是还原烷化法，另一种是氧化法。(1)还原烷化法还原烷化法 产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4乙烯乙烯吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性剂要用剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。(2)氧化法氧化法 氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一 缺点，必缺点，必须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨基酸的组成数据。次则提供其他氨基酸的组成数据。第四节第四节 氨基酸组成原位分析氨基酸组成原位分析如果蛋白质样品采用电泳法如果蛋白质样品采用电泳法(如如SDS-PAGE)分离，则很难从凝胶中洗分离，则很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移到脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF膜上，然后在膜上，然后在PVDF膜上直膜上直接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位(in situ)分析。因为通常分析。因为通常所用聚丙烯酰胺凝胶分离系统中含大量甘氨酸和所用聚丙烯酰胺凝胶分离系统中含大量甘氨酸和Tris盐，易干扰氨基酸盐，易干扰氨基酸原位分析，故改用原位分析，故改用CAPS缓冲系统以减少影响。另外，在膜上做氨基酸缓冲系统以减少影响。另外，在膜上做氨基酸组成分析时可以做一个空白对照，具体操作时将含蛋白条带的组成分析时可以做一个空白对照，具体操作时将含蛋白条带的PVDF膜膜割下，另取一条相同面积的转移膜作为空白，分别置于水解指管中割下，另取一条相同面积的转移膜作为空白，分别置于水解指管中,加入加入70l含含7(m/V)巯基乙酸的巯基乙酸的6mol/L盐酸以防止抽真空时膜片的漂盐酸以防止抽真空时膜片的漂出，将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入出，将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入200l含含7巯基巯基乙酸的乙酸的6mol/L盐酸，盐酸，110真空水解真空水解24h，水解结束后用，水解结束后用200l含含30甲醇的甲醇的0.1mol/L盐酸反复三次将氨基酸从盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来，以便膜中抽提出来，以便进行下一步的分析。进行下一步的分析。(1)茚三酮法茚三酮法 Spackman等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分析上。离子交换层析后，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色析上。离子交换层析后，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色化合物，最大光吸收在化合物，最大光吸收在570nm，摩尔消光系数，摩尔消光系数2X104，茚，茚三酮和二级胺三酮和二级胺(脯氨酸和羟脯氨酸脯氨酸和羟脯氨酸)形成黄色产物，在形成黄色产物，在440nm检出，摩尔消光系数检出，摩尔消光系数3X103。目前此法的灵敏度可。目前此法的灵敏度可达达100pmol，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保存，试剂本身黏性大，需要有个柱后混合器才能与氨基酸充存，试剂本身黏性大，需要有个柱后混合器才能与氨基酸充分反应，对仪器要求较高。分反应，对仪器要求较高。(2)柱后荧光胺法柱后荧光胺法 20世纪世纪70年代合成了荧光胺，它能在室温下迅速和一级年代合成了荧光胺，它能在室温下迅速和一级胺发生反应，其荧光产物的激发波长胺发生反应，其荧光产物的激发波长Ex390nm，发射波长，发射波长Em475nm。次级胺可以用。次级胺可以用N-Chlorosuccinimide(NCS)氧化生成相应的初级胺后再与荧光胺反应而检出。氧化生成相应的初级胺后再与荧光胺反应而检出。(3)邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)法法 OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反应中。应中。OPA能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很强荧光的异能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很强荧光的异吲哚衍生物，反应迅速，在室温下吲哚衍生物，反应迅速，在室温下1min即可完成，反应络合物的即可完成，反应络合物的Ex340360nm，Em455nm，灵敏度比茚三酮法高，在，灵敏度比茚三酮法高，在 OPA中加入中加入SDS或表面活性剂或表面活性剂Brij35，不但能提高赖氨酸和羟赖氨酸的稳定性，不但能提高赖氨酸和羟赖氨酸的稳定性，而且能提高它们的荧光度。缺点是不能检测次级氨基酸，但可用稀的而且能提高它们的荧光度。缺点是不能检测次级氨基酸，但可用稀的Na-hypochlorite在碱性条件下氧化成相应的一级胺，然后再与在碱性条件下氧化成相应的一级胺，然后再与OPA反反应。应。0PA/FMOC作为柱前衍生剂能同时与一级胺和二级胺反应，室温下只作为柱前衍生剂能同时与一级胺和二级胺反应，室温下只需几分钟，需几分钟，Hewlett Packard公司改用巯基丙酸公司改用巯基丙酸(3-MPA)引代替巯基乙引代替巯基乙醇。由于醇。由于3-MPA的加入，异吲哚衍生物疏水性降低，使出峰时间提前，的加入，异吲哚衍生物疏水性降低，使出峰时间提前，过量的过量的FMOC及其分解产物的出峰时间在最后，被洗脱出的次级氨基酸及其分解产物的出峰时间在最后，被洗脱出的次级氨基酸之后，不干扰分析结果。之后，不干扰分析结果。(4)PTC-AA分析法分析法 属柱前衍生法，源于属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质的一级结降解法测定蛋白质的一级结构。异硫氰酸苯酯构。异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应，能在碱性条件下和氨基酸反应，生成生成PTC-AA，此法分析灵敏度和荧光胺、，此法分析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法的荧光法相同，优点是能同时检出初级和次级氨基酸，在相同，优点是能同时检出初级和次级氨基酸，在254nm检检出，缺点是操作繁琐，水和盐的副反应敏感，要求较高的操出，缺点是操作繁琐，水和盐的副反应敏感，要求较高的操作技术。作技术。(5)Dansyl-Cl法法 能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的荧光产物，但反能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的荧光产物，但反应耗时。应耗时。(6)Dabsyl-Cl法法 灵敏度是灵敏度是Dansyl-Cl法法1/5，但由于反应产生有色衍生，但由于反应产生有色衍生物，能方便地在物，能方便地在254nm和和425nm处用紫外检测。有报道用处用紫外检测。有报道用DABITC代替代替Dabsyl-Cl，反应产生，反应产生DABTH-AA，在酸性，在酸性环境中显红色，易在环境中显红色，易在254nm，269nm和和436nm检测。检测。第七节第七节 结结 语语 影响氨基酸分析准确性和重复性的因素有三个：影响氨基酸分析准确性和重复性的因素有三个：一是样品的水解。水解时间、水解温度、真空度、样品是否一是样品的水解。水解时间、水解温度、真空度、样品是否被氧化等，都影响实验的结果；被氧化等，都影响实验的结果；二是氨基酸的有效的衍生情况；二是氨基酸的有效的衍生情况；三是氨基酸色层分离好坏。不同样品采用不同的分析方法，三是氨基酸色层分离好坏。不同样品采用不同的分析方法，生理样品含有生理样品含有3050种氨基酸，用离子交换色谱柱后衍生种氨基酸，用离子交换色谱柱后衍生法比较合适，天然氨基酸、合成多肽样品的氨基酸测定多采法比较合适，天然氨基酸、合成多肽样品的氨基酸测定多采用反相色谱柱前衍生分析方法。食品和饲料中氨基酸分析采用反相色谱柱前衍生分析方法。食品和饲料中氨基酸分析采用上述两种方法均可。因为反相色谱柱前衍生法具有快速和用上述两种方法均可。因为反相色谱柱前衍生法具有快速和灵敏的特点，在药物和手性氨基酸的分析中同样也获得广泛灵敏的特点，在药物和手性氨基酸的分析中同样也获得广泛的应用。的应用。几种氨基酸分析法各有利弊，实验者应根据自己的几种氨基酸分析法各有利弊，实验者应根据自己的实际情况，如精确性、方便性、经济性等来选择合适的方实际情况，如精确性、方便性、经济性等来选择合适的方法。法。