第二章DNA重组技术与基因操作

基因工程研究的理论依据基因工程研究的理论依据n不同基因具有相同的物质基础n基因是可以切割的n基因是可以转移的n多肽与基因之间存在对应关系n遗传密码是通用的n基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代DNADNA重组技术要有四重组技术要有四个必要条件：个必要条件：工具酶、工具酶、基因、基因、载体、载体、受体细胞受体细胞 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别识别并切开并切开核酸序列特定位点核酸序列特定位点分子手术刀分子手术刀 ArberArber、SmithSmith和和NathansNathans因为在发现限制性内切酶方面因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了开创性工作而共同获得了19781978年的诺贝尔年的诺贝尔奖。奖。核酸内切限制酶的类型及其主要特性核酸内切限制酶的类型及其主要特性 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个伸出的核苷带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互酸，它们之间正好互补配对，这样的切口补配对，这样的切口叫做叫做 粘性末端。粘性末端。EcoEcoRIRI特异识别特异识别GAATTCGAATTC及其互补碱及其互补碱基组成的双链片段基组成的双链片段SmaSma特异识别特异识别CCCGGG,CCCGGG,形成平形成平末端末端5CCC GGG3 GGG CCC5CCC GGGGGG3CCC2、star activity：指当酶的反应条件改变时，其在识别：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度产生的原因：反应体系中甘油的浓度12；酶：；酶：DNA比率比率25u/g；缺少；缺少Nacl和存在和存在Mn2。连接的部位连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。不是氢键（梯子的踏板）。四、修饰酶四、修饰酶5 HOOH 3HOOH355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端532 POH 3HO32P3532P ATP5 POH 3HOP355突出末端突出末端5隐蔽末端隐蔽末端OHHO5HOOH 335一、质粒一、质粒(plasmid)(plasmid)AOCSCL穿梭质粒穿梭质粒:人工人工构建的具有两种构建的具有两种不同复制起点和不同复制起点和选择记号，可在选择记号，可在两种不同的寄主两种不同的寄主细胞中存活和复细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体。二、二、噬菌体噬菌体 噬菌体也可以进入溶源循噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的环，即注入的DNADNA整合到大整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久菌体的形式潜伏起来，永久保留。保留。整合切割区域整合切割区域尾部尾部基因基因头部头部基因基因粘性粘性末端末端粘性粘性末端末端负责负责DNA复复制的基因制的基因细胞裂细胞裂解基因解基因噬菌体的噬菌体的DNA示意图示意图左臂左臂右臂右臂噬菌体噬菌体DNA分子示意图分子示意图应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序利用柯斯质粒克隆大片段利用柯斯质粒克隆大片段DNApYAC4结构图结构图分：1、细胞内总DNA的提取分离l 细胞内总DNA的提取分离程序l 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。2 2、基因重组的方法、基因重组的方法：1 1）根据外源）根据外源DNADNA片段末片段末端的性质同载体上适当端的性质同载体上适当的酶切位点相连实现基的酶切位点相连实现基因的体外重组因的体外重组。磷酸化磷酸化5TCGAAGCT5xho I5GATCCTAG5Sau3A I5TCGAAGCT5CTTC5GATCCTAG5AGGCdCTP、dTTP、dATP、dGTPKlenown酶酶Pst1质粒质粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端转移酶加（用末端转移酶加（dG）残基）残基用末端转移酶加（用末端转移酶加（dC）残基）残基以以oligo(dT)作引物作引物合成合成cDNA第一链第一链合成合成cDNA第二链第二链退火退火CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCC G G CCCCCCTTTTTTTGGGGGGACGTC转化适当的大肠杆菌菌株选转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性择抗生素抗性转化过程中，转化过程中，DNA上的缺口为宿上的缺口为宿主酶所修复，从而在主酶所修复，从而在cDNA两端恢两端恢复复Pst1位点位点Pst1Pst1cDNA3 3、重组、重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1)1)转化：转化：由于外源由于外源DNADNA的进入而使细胞遗传性改变称的进入而使细胞遗传性改变称为转化。采取一些方法处理细胞经处理后的细胞就为转化。采取一些方法处理细胞经处理后的细胞就容易接受外界容易接受外界DNADNA，称为感受态细胞：再与外源，称为感受态细胞：再与外源DNADNA接接触，就能提高转化效率。触，就能提高转化效率。4、一般克隆基因的检查和鉴定方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率分子量标准参照物l 酶切和电泳方法宿主生长宿主生长 依赖依赖Leu重组体重组体+目的基因目的基因 能够合成能够合成Leu 在没有在没有Leu存在时存在时 能生长（已转化）能生长（已转化）重组体转化的细菌中重组体转化的细菌中 在没有在没有Leu存在时存在时 不生长（没有转化）不生长（没有转化）原位杂交原位杂交点杂交和点杂交和southernsouthern杂交杂交（1 1）提取总）提取总DNADNA（2 2）酶解）酶解（3 3）电泳）电泳（4 4）转移到滤膜）转移到滤膜（5 5）变性解链）变性解链（6 6）DNADNA探针及杂交探针及杂交（7 7）洗脱）洗脱（8 8）放射自显影）放射自显影（9 9）比较分析）比较分析SouthernSouthern杂交杂交 A.DNAA.DNA体外重组实验体外重组实验 B.B.抗生素筛选转化子细抗生素筛选转化子细胞胞 C.C.培养突变株细胞培养突变株细胞 D.SouthernD.Southern杂交实验结杂交实验结果显示，外源目的基因已果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中经转入突变株细胞中SouthernSouthern杂交分析示例杂交分析示例LacZ+EcoRIEcoRIEcoRILacZ感染感染在培养基上培养菌落在培养基上培养菌落转膜转膜菌落的蛋白质裸露出来菌落的蛋白质裸露出来一抗与裸露的蛋白质结合一抗与裸露的蛋白质结合二抗与一抗结合二抗与一抗结合显色显色找出阳性克隆找出阳性克隆裂解裂解加一抗加一抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的二抗，加显色剂洗去游离的二抗，加显色剂克隆克隆PCR产物；产物；通用引物：通用引物：pUC/M13 primer8)、DNA的序列分析：的序列分析：这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最确定的方法。同序列的唯一方法，也是最确定的方法。第四节第四节 获得真核生物目的基因的方法获得真核生物目的基因的方法一、鸟枪法（一、鸟枪法（shot gun）鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因随机克隆供体细胞的全基因组组DNADNA片段，然后通过快速有片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中效的筛选程序从众多克隆中分离出含有分离出含有目的基因的目的目的基因的目的重组子重组子，进而获得目的基因，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离的基因的克隆分离 .2 2、在连接前将、在连接前将DNA片段进行分片段进行分级分离级分离 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb的的SalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNA用用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于用刀片切下相当于1.6-2.0 kb大大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收回收DNA片段，然后与载体进行拼片段，然后与载体进行拼接接2.0 kb1.6 kb1.8 kb 随机随机引物引物自身引导法自身引导法反转录酶反转录酶RNaseH（部分降解）（部分降解）DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶RNA55cDNA第一链第一链33RNA55555555cDNA第一链第一链3cDNA第二链第二链置置换换合合成成法法组组织织或或细细胞胞染染色色体体D DN NA A限制性内切酶基因片段克隆载体重重组组D DN NA A分分子子受体菌含重组分子的转化菌mRNA逆转录酶cDNA复制双双链链c cD DN NA A载体重重组组D DN NA A分分子子受体菌含重组分子的转化菌三、三、DNA的化学合成的化学合成基因的化学合成及克隆图解基因的化学合成及克隆图解535353退火退火DNA连接酶连接酶退火退火DNA连接酶连接酶退火退火DNA连接酶连接酶退火退火T4DNA连接酶连接酶EcoRBamH合成的合成的DNA全基因全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因合成的基因转化转化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的合成的基因基因基因的化学酶促合成图解基因的化学酶促合成图解磷酸化磷酸化退火退火DNA多聚酶多聚酶Iklenow片段片段dNTP限制性内切酶限制性内切酶分子克隆分子克隆55551、PCR技术的发明 PCRPCR的发明是的发明是DNADNA操作技术的革命操作技术的革命 美国美国MullisMullis教授教授 开汽车时的联想开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路逶迤崎岖的山路DNADNA双螺旋双螺旋 行驶的汽车行驶的汽车一小段一小段DNADNA引物引物 19881988年发明了年发明了PCRPCR技术技术 19931993年获得诺贝尔奖年获得诺贝尔奖四、利用四、利用PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR分离基因分离基因Mullis开车的时候开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面的两条链，自己的车和对面开来的车象是开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA，PCR 动画动画过过 程程4 4、逆转录、逆转录PCRPCR（retrotranscription PCR,RT-retrotranscription PCR,RT-PCRPCR）:帽子帽子AAAAA mRNA35TTTTT以其为模板进行以其为模板进行PCR扩增扩增逆转录逆转录合成合成cDNA互补链并退火互补链并退火寡聚寡聚dT引物引物5 5、锚定、锚定PCRPCR：53DNA序列序列GGGGG 353GGGGG5GGGGG 353GGGGG5锚定引物锚定引物CCCCC（多聚（多聚dC引物）引物）进行进行PCR扩增扩增5GGGGG 3CCCCC加多聚加多聚dG尾巴尾巴加入引物加入引物已知序列已知序列扩出的未知序列扩出的未知序列6 6、反向、反向PCRPCR53LR酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点LR已知序列已知序列限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解环化环化REabadcdc直接测序或克直接测序或克隆后再测序隆后再测序1、正向、反向正向、反向SSH5GTAAAAA3polyAmRNA反转录反转录5T11-12MN35GTAAAAA33CATTTTT5cDNA 第一链第一链5GTAAAAA33CATTTTT5变性变性变性变性3端锚定引物寡核苷酸，端锚定引物寡核苷酸，5端随机引物端随机引物5GTAAAAA33CATTTTT53TTT5CATTCATTTTT53延伸延伸TTT5CATT35GTAAAAA3cDNA 第二链第二链变性变性退火退火延伸延伸电泳电泳显带显带mRNA DDmRNA DD技术原理图技术原理图外源基因在宿主细胞中的高效表达外源基因在宿主细胞中的高效表达外源基因在宿主细胞中的高效表达外源基因在宿主细胞中的高效表达用同聚物加尾法再生用同聚物加尾法再生Hind识别位识别位点点AAGCTTTTCGAA载体分子载体分子35加加Hind酶酶AAGCTTTTCGAA553355AAGTCAGCTTTTCGATGCAA5353dNTPs+Klenow酶酶待克隆的待克隆的DNA片段片段53加加dATP末端转移末端转移酶酶poly(dA)加尾加尾加加dATP末端转移末端转移酶酶poly(dT)加尾加尾5AAA(n)3(n)AAAAAGCTTT(n)AGCTTTTCGA(n)TTTCGAA5353+连接酶连接酶AAGCTTT(n)(n)AAAGCTTTTCGAAA(n)(n)TTTCGAA5353Hind位点位点