9第九讲PCR技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）PCR技术：概念：通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。广泛用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。PCRPCR技术产生的历史背景技术产生的历史背景 19711971年，年，KhoranaKhorana等人就提出了利用等人就提出了利用PCRPCR在体外扩在体外扩增增DNADNA的概念；的概念；SaikiSaiki（19851985）和）和MullisMullis（19861986）两家研究室分别）两家研究室分别用改进的用改进的KleppeKleppe法获得了大量染色体法获得了大量染色体DNADNA单拷贝基单拷贝基因；因；19881988年，年，ChienChien从水生栖热菌（从水生栖热菌（Thermus Thermus aquaticusaquaticus）中分离出耐热）中分离出耐热DNADNA聚合酶，简称聚合酶，简称Taq Taq DNADNA聚合酶；聚合酶；MullisMullis正式确定了体外扩增正式确定了体外扩增DNADNA技术，技术，19871987年获得年获得专利，命名为专利，命名为Polymerase Chain Reaction(PCR)。PCR反应的基本过程反应的基本过程 PCR PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步延伸三个基本反应步骤构成：骤构成：变性变性(denaturation)(denaturation)将模板将模板DNADNA置于置于92929696处理，使处理，使dsDNAdsDNA链解开成为链解开成为ssDNAssDNA，以便它与引物结合，以便它与引物结合.PCR反应的基本过程反应的基本过程 退火退火(annealing)(annealing)模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列单链的互补序列配对结合成局部双链；配对结合成局部双链；PCR反应的基本过程反应的基本过程 延伸延伸 DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶的催化作用下，以的催化作用下，以dNTPdNTP为反应原料，按碱基为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，引物沿配对与半保留复制原理，引物沿5353方方向延伸，最终合成一条新的与模板向延伸，最终合成一条新的与模板DNADNA链互链互补的补的DNADNA链。链。PCR反应的基本要素反应的基本要素 模板模板DNADNA TaqTaq酶酶 dNTPdNTP 引物引物 MgMg2+2+Template DNA 模板模板DNADNA的数量与纯度，是的数量与纯度，是PCRPCR成败与否的关成败与否的关键环节之一。但不同类型键环节之一。但不同类型PCRPCR反应对模板反应对模板DNADNA数量与纯度的要求不同。数量与纯度的要求不同。数量：数量：3 310106 6个拷贝个拷贝 酵母菌酵母菌 10ng10ng 细菌细菌 1ng 1ng 质粒质粒 1pg1pg 纯度纯度:RAPD OD:RAPD OD260260/OD/OD280280=1.6=1.61.91.9 AFLP OD AFLP OD260260/OD/OD280280=1.7=1.71.8 1.8 DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 来源：古细菌嗜热水生菌来源：古细菌嗜热水生菌(thermus aquaticusthermus aquaticus)特点：特点：耐高温，在耐高温，在7070下反应下反应2 h2 h后其残留活性大于后其残留活性大于90%90%，在，在9595下反应下反应2 h2 h后为后为40%40%；在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶；后再加新酶；大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度了扩增长度(2.0 kb)(2.0 kb)；具有具有5533外切酶活性外切酶活性，但但无无3355外切外切酶活性酶活性，因而对某些单核苷酸错配因而对某些单核苷酸错配无无校正功能。校正功能。pfu DNA Polymerase 来源：来源：是从是从Pyrococcus furiosisPyrococcus furiosis 中精制而成的高中精制而成的高保真耐高温保真耐高温DNADNA聚合酶。聚合酶。特点：特点：它不具有它不具有5353外切酶活性，但具有外切酶活性，但具有3535外切酶活性，因而可纠正外切酶活性，因而可纠正PCR PCR 过程中产生的错误，过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低；使产物的碱基错配率极低；PCRPCR产物为平端，无产物为平端，无33端突出的单端突出的单A A核苷酸，不核苷酸，不能进行能进行T-AT-A克隆。克隆。Vent DNA Polymerase 来源：来源：从嗜热高温球菌从嗜热高温球菌(Thermococcus(Thermococcus LitoralisLitoralis)中分离出的。中分离出的。特点：特点：不具有不具有5353外切酶活性，但具有外切酶活性，但具有3535外切酶活性，可以去除外切酶活性，可以去除33错配的碱基，具有校对错配的碱基，具有校对功能；功能；PCRPCR产物为平端，无产物为平端，无33端突出的单端突出的单A A核苷酸，不核苷酸，不能进行能进行T-AT-A克隆；克隆；PCRPCR产物的扩增长度可达产物的扩增长度可达10kb10kb以上。以上。Primers（引物）引物：在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。primers 随机引物：随机引物：引物为随机设计的短序列，通引物为随机设计的短序列，通常为常为10bp10bp左右，扩增产物的非特异性高，左右，扩增产物的非特异性高，易受扩增条件影响；易受扩增条件影响；特异引物：特异引物：引物根据特定的引物根据特定的DNADNA序列设计而序列设计而成，扩增产物的特异性强；成，扩增产物的特异性强；简并引物：简并引物：是根据密码子的简并性原则，是根据密码子的简并性原则，以蛋白质序列中的氨基酸保守区反向设计以蛋白质序列中的氨基酸保守区反向设计而成的，扩增产物的特异性比较强。而成的，扩增产物的特异性比较强。InsuF 5-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3 InsuR 5-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3 其中其中 Y=C/T N=A/T/C/G K=G/T R=A/G PCR引物设计的基本原则引物设计的基本原则 合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平衡点。1 引物长度通常1830bp；2 解链温度(Tm);Tm=4(G+C)+2(A+T)3 GC含量以40%60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；PCR引物设计的基本原则引物设计的基本原则 4 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；5 避免引物内部出现二级结构，以及避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；6 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；7 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；8 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG 421 GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT 421 GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT 481 GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT 481 GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT 541 GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTGAGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT 541 GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTGAGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT 601 CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT 601 CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT 661 TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC 661 TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC 721 CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT 721 CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT dNTPs dNTP的质量、浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTP溶液的pH为7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。反复冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的摩尔浓度要相等，如果其中任何一种浓度不同，就会引起错配。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度 Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。Mg2+对PCR的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度以1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分 1010PCR Buffer PCR Buffer MgClMgCl2 2或或MgSOMgSO4 4 dNTP Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)dNTP Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)引物引物 (随机引物或特异引物随机引物或特异引物)模板模板DNA DNA Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase ddHddH2 2O O 常规常规PCR反应体系反应体系 10PCR Buffer 2.5ul MgCl2(25mM)2.0ul dNTP(10mM)0.2ul Forward primer(10uM)1.0ul Reverse primer(10uM)1.0ul 模板模板DNA 50ng Taq酶酶(5U/ul)0.2ul ddH2O to 25ul 在反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期效应。原因：1 反应开始时反应系统中作为模板的DNA拷贝数过多，当PCR经过一定次数循环后，使DNA聚合酶不足以催化已扩增的DNA片段作为模板进行继续扩增。2 反应系统中加入的引物或dNTP的量不足，或者是DNA聚合酶中途失活。PCR反应程序优化的基本原则1 温度与时间的设置 在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA聚合酶的作用下，引物链沿模板延伸。较短靶序列(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394 l min足以使模板DNA变性，但温度过高对酶的活性有影响。此步若不能使模板DNA完全变性，就会导致PCR失败。退火温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)延伸温度与时间 PCR反应的延伸温度常用72。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定：1 kb的靶序列 延伸时间1min；34kb的靶序列 延伸时间34min；10kb以上的靶序列 延伸时间15min。2 循环次数 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在2540次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。SRAP-PCR的反应程序：94 5min 94 1min 35 1min 72 1min 94 1min 50 1min 72 1min 72 10min （杨琦，大白菜SRAP反应体系的建立与优化）5个循环 35个循环PCR的优点1 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。2 灵敏度高 能将pg级的起始待测模板扩增到ug水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。3 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行扩增反应，一般在24小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。4 对样本DNA的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA样品进行PCR检测。PCR过程中常出现的问题假阴性：不出现扩增条带 原因：1、模板 2、酶 3、引物 4、Mg2+5、反应体积的改变 6、物理原因 7、靶序列变异 1 模板 模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。2 酶失活 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶。3 引物 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。对策为：引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。重新设计引物。4 Mg2+浓度 Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。5 反应体积的改变 通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。6 物理原因 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。7 靶序列变异 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性：假阳性：出现的出现的PCRPCR扩增条带与目的靶序列条带扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。一致，有时其条带更整齐，亮度更高。原因：原因：引物设计不合适；引物设计不合适；靶序列或扩增产物的交叉污染。靶序列或扩增产物的交叉污染。1 引物设计不合适 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。2 靶序列或扩增产物的交叉污染 这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。解决措施：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带：出现非特异性扩增带：PCRPCR后出现的条带与预计的大小不一致，或者后出现的条带与预计的大小不一致，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：原因：引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体；聚体；MgMg2+2+离子浓度过高、退火温度过低，及离子浓度过高、退火温度过低，及PCRPCR循环循环次数过多有关；次数过多有关；酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。会出现非特异性扩增。出现出现SmearSmear现象：现象：PCRPCR扩增呈现涂抹带或片状扩增呈现涂抹带或片状带或地毯样带。带或地毯样带。原因：原因：TaqTaq酶量过多或酶的质量差；酶量过多或酶的质量差；dNTPdNTP浓度过高；浓度过高；MgMg2+2+浓度过高；浓度过高；退火温度过低；退火温度过低；循环次数过多引起。循环次数过多引起。PCR的应用的应用 种子纯度鉴定、品种鉴定等；种子纯度鉴定、品种鉴定等；物种亲源关系与系统进化的研究；物种亲源关系与系统进化的研究；分子标记辅助育种选择；分子标记辅助育种选择；基因组图谱的构建；基因组图谱的构建；基因的定位与分离、鉴定等；基因的定位与分离、鉴定等；环境和食品污染监测等。环境和食品污染监测等。思考题：思考题：1、PCR反应体系是什么？2、PCR反应程序是什么？