PCR、RT-PCR技术

PCRPCR、RT-PCRRT-PCR技术技术20112011年年0606月月1414日日 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCRPCR是由美国科学家是由美国科学家聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是是 80 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。该方法该方法能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接使肉眼能直接观察和判断；观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的的DNADNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用做到的事情，用PCRPCR几小时便可完成。几小时便可完成。PCRPCR技术概论技术概论 类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。列两端互补的寡核苷酸引物。PCRPCR由由变性变性-退火退火-延伸延伸三个基本反应步骤构成：三个基本反应步骤构成：模板模板DNADNA的的变性变性：模板：模板DNADNA经加热至经加热至9393左右一定时间左右一定时间后，使模板后，使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；备；模板模板DNADNA与引物的与引物的退火退火(复性复性)：模板：模板DNADNA经加热变性成经加热变性成单链后，温度降至单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的单链的互补序列配对结合；互补序列配对结合；PCRPCR原理原理引物的引物的延伸延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性链互补的半保留复制链重复循环变性-退火退火-延伸三延伸三过程，就可获得更多的过程，就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 24 4分钟，分钟，2 23 3小时就能将待扩目的基因扩增放大小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。几百万倍。PCRPCR原理原理标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 10 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul10ul 4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L 引物引物 1010100pmol100pmol 模板模板DNA 0.1DNA 0.12ug2ug TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5u Mg2+1.5mmol/L Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul100ulPCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primerprimer）酶酶 （TaqTaq DNA polymerase DNA polymerase）dNTPdNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板模板 （templatetemplate）Mg2+Mg2+（magnesiummagnesium）引物引物l引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键特异性反应的关键lPCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度互补的程度l理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCRPCR就可将模板就可将模板 DNA DNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择温度与时间的设置：温度与时间的设置：l设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点l标准反应中采用三温度点法，双链标准反应中采用三温度点法，双链DNADNA在在90909595变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 40 6060，引物退火并结合，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至到靶序列上，然后快速升温至70707575，在，在TaqTaq D DNA NA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸.l对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100100300bp300bp时）可采用二时）可采用二温度点法，温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采将退火与延伸温度合二为一，一般采用用9494变性，变性，6565左右退火与延伸左右退火与延伸.变性温度与时间：变性温度与时间：l变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败的最主要原失败的最主要原因因l一般一般939394lmin94lmin足以使模板足以使模板DNADNA变性变性若低于若低于9393则需延长时间则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。响。l此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCRPCR产物完全变性，就会产物完全变性，就会导致导致PCRPCR失败失败。退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：l退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素l变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至40406060，可使引物和，可使引物和模板发生结合。由于模板模板发生结合。由于模板DNA DNA 比引物复杂得多，比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互 补链之间的碰撞补链之间的碰撞。l退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度及其浓度，还有靶基序列的长度。l对于对于2020个核苷酸，个核苷酸，G+CG+C含量约含量约50%50%的引物，的引物，5555为为 选择最适退火温度的起点较为理想选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：lTmTm值（解链温度）值（解链温度）=4=4（G+CG+C）2 2（A+TA+T）l复性温度复性温度=Tm=Tm值值-（5 51010）在在TmTm值允许范围内，选择较高的复性温度可大值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCPCR R反应的特异性。反应的特异性。l复性时间一般为复性时间一般为303060sec60sec，足以使引物与模板之足以使引物与模板之间完全结合间完全结合。延伸温度与时间：延伸温度与时间：TaqTaq DNA DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：707080 15080 150核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 6070 60核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 55 2455 24核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 高于高于9090时，时，DNADNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行。循环次数循环次数u循环次数循环次数决定决定PCRPCR扩增程度扩增程度u循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度u循环次数：选在循环次数：选在30304040次之间次之间u循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCRPCR反应特点反应特点u特异性强特异性强u灵敏度高灵敏度高u简便、快速简便、快速u对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低。特异性强特异性强u关键：引物与模板的正确结合关键：引物与模板的正确结合。u引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则原则。u合成反应的忠实性及合成反应的忠实性及TaqTaq DNA DNA聚合酶耐高温性，使聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。PCRPCR反应的特异性决定因素反应的特异性决定因素u引物与模板引物与模板DNADNA特异正确的结合；特异正确的结合；u碱基配对原则；碱基配对原则；uTaqTaq DNA DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性；u靶基因的特异性与保守性靶基因的特异性与保守性。灵敏度灵敏度高高PCR PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 (pg=10-12)(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克量级的起始待测模板扩增到微克 (ugug=10-6)=10-6)水平水平。从从 100 100 万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞。在病毒的检测中，在病毒的检测中，PCR PCR 的灵敏度可达的灵敏度可达 3 3 个个RFU(RFU(空空斑形成单位斑形成单位)。在细菌学中最小检出率为在细菌学中最小检出率为3 3个细菌个细菌。简便、快速简便、快速PCRPCR反应用耐高温的反应用耐高温的 TaqTaq DNA DNA聚合酶，一次性地将聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在反应液加好后，即在DNA DNA 扩增液和水浴锅上进行变扩增液和水浴锅上进行变性性-退火退火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在2-4 2-4 小时完成扩增反应。小时完成扩增反应。扩 增 产 物 一 般 用 电 泳 分 析，不 一 定 要 用 同 位扩 增 产 物 一 般 用 电 泳 分 析，不 一 定 要 用 同 位 素，无放射性污染、易推广素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需分离病毒或细菌及培养细胞，不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA DNA 粗制品及总粗制品及总 RNA RNA 均可作为扩增模板。均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发细胞、活组织等粗制的细胞、活组织等粗制的DNADNA扩增检测扩增检测。无扩增产物无扩增产物现象：现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无 原因原因1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.引物设计不当或发生降解引物设计不当或发生降解3.3.反应条件：退火温度太反应条件：退火温度太 高，延伸时间太短高，延伸时间太短对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂纯化模板或者使用试剂盒提取模板盒提取模板DNADNA或或加大加大模板的用量模板的用量2.2.重新设计引物（避免链重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物构）或者换一管新引物3.3.降低退火温度、延长延降低退火温度、延长延伸时间伸时间非特异性扩增非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致扩增后出现的条带与预计的大小不一致 或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。增带。非特异性扩增非特异性扩增 原原因因1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈SmearSmear状态。状态。M 1 2拖尾拖尾 原原因因1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数假阳性假阳性 现象：现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物原因：原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 对策：对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心 管外；管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。RT-PCRRT-PCR基础基础 RT-PCRRT-PCR将以将以RNARNA为模板的为模板的cDNAcDNA合成同合成同PCRPCR结合在结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCRRT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项 技 术 还 可 以 用 来 检 测 基 因 表 达 差 异 或 不 必项 技 术 还 可 以 用 来 检 测 基 因 表 达 差 异 或 不 必 构建构建cDNAcDNA文库克隆文库克隆cDNAcDNA。RT-PCRRT-PCR原理简介原理简介RNAcDNA目的目的片段片段PCRRTcDNAcDNA第一链合成法示意图（两步法）第一链合成法示意图（两步法）一步法实验示意图（同一个反应管中一步法实验示意图（同一个反应管中）RT-PCRRT-PCR两种方法两种方法RTRT引物的选择引物的选择提取提取RNARNA合成合成cDNAcDNA分离高质量分离高质量RNARNA 成功的成功的cDNAcDNA合成来自高质量的合成来自高质量的RNARNA。高质量的。高质量的RNARNA至至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂。少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂。RNARNA的质的质量决定了你能够转录到量决定了你能够转录到cDNAcDNA上的序列信息量的最大上的序列信息量的最大值。值。TrizolTrizol试剂法可以从最少试剂法可以从最少100100个细胞或个细胞或1mg1mg组织组织 中提取中提取RNARNA。增加增加RT-PCRRT-PCR灵敏度方法灵敏度方法 逆转录酶催化逆转录酶催化RNARNA转化成转化成cDNAcDNA。在本身的聚合酶活性。在本身的聚合酶活性之外，都具有内源之外，都具有内源RNaseHRNaseH活性。活性。RNaseHRNaseH活性同聚合酶活性同聚合酶活性相互竞争活性相互竞争RNARNA模板与模板与DNADNA引物或引物或cDNAcDNA延伸链间形成延伸链间形成的杂合链。被的杂合链。被RNaseHRNaseH活性所降解的活性所降解的RNARNA模板不能再作模板不能再作为合成为合成cDNAcDNA的有效底物，降低了的有效底物，降低了cDNAcDNA合成的产量和长合成的产量和长度度。使用无使用无RNaseHRNaseH活性的逆转录酶活性的逆转录酶 RNaseHRNaseH处理对处理对RT-PCRRT-PCR的影响的影响 SuperScriptSuperScript（S S）、）、M-MLVM-MLV（M M）或）或AMVAMV（A A）逆转录酶对逆转录酶对RT-PCRRT-PCR灵敏度的影响灵敏度的影响 逆转录酶对长模板逆转录酶对长模板RT-PCRRT-PCR灵敏度的影响灵敏度的影响 较高的保温温度有助于较高的保温温度有助于RNARNA二级结构的打开，增加了二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数反应的产量。对于多数RNARNA模板，在没有缓冲液或盐模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将的条件下，将RNARNA和引物在和引物在6565保温，然后迅速置于保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对困难模板的扩增可以使用是如此。对困难模板的扩增可以使用ThermoScriptThermoScript逆逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。扩增。提高逆转录保温温度提高逆转录保温温度 温度对不同模板的影响温度对不同模板的影响 起始起始cDNAcDNA合成合成 第一链第一链cDNAcDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成种方法的相对特异性影响了所合成cDNAcDNA的量和种类。的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的 cDNAcDNA。这种方法经常用于获取。这种方法经常用于获取55末端序列及从带有二末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNRNA A模板获得模板获得cDNAcDNA。增加增加RT-PCRRT-PCR特异性方法特异性方法 Oligo(dTOligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞核细胞mRNA 3mRNA 3端所发现的端所发现的poly(Apoly(A)尾杂交。因为尾杂交。因为polpoly(A)+RNAy(A)+RNA大概占总大概占总RNARNA的的1%1%到到2 2，所以与使用随机引，所以与使用随机引物相比，物相比，cDNAcDNA的数量和复杂度要少得多，具有较高的的数量和复杂度要少得多，具有较高的特异性。特异性。GSPGSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNARNA目的序列目的序列杂交，而不象随机引物或杂交，而不象随机引物或oligo(dToligo(dT)那样同所有那样同所有RNARNA退火。用于设计退火。用于设计PCRPCR引物的规则同样适用于逆转录反引物的规则同样适用于逆转录反应应GSPGSP的设计。的设计。GSPGSP可以同与可以同与mRNA3mRNA3最末端退火的扩最末端退火的扩增引物序列相同，或增引物序列相同，或GSPGSP可以设计为与反向扩增引物可以设计为与反向扩增引物 的下游退火。的下游退火。为了充分利用为了充分利用GSPGSP特异性的全部优点，应该使用有较特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSPGSP退火温度为退火温度为5555，那么如果使用，那么如果使用AMVAMV或或M-MLVM-MLV在低严在低严谨性的谨性的3737进行逆转录，进行逆转录，GSPGSP所带有的特异性就没有所带有的特异性就没有完全利用。然而完全利用。然而SuperScripSuperScrip和和ThermoScriptThermoScript可以可以在在5050或更高进行反应，可消除较低温度时产生的或更高进行反应，可消除较低温度时产生的 非特异性产物。非特异性产物。提高逆转录保温温度提高逆转录保温温度 逆转录温度对逆转录温度对RT-PCRRT-PCR特异性的影响特异性的影响 RT-PCRRT-PCR所遇到的一个潜在的困难是所遇到的一个潜在的困难是RNARNA中沾染的基中沾染的基因组因组DNADNA。使用较好的。使用较好的RNARNA分离方法，如分离方法，如TrizolTrizol Rea Reagentgent，会减少，会减少RNARNA制备物中沾染的基因组制备物中沾染的基因组DNADNA。为了。为了避免产生于基因组避免产生于基因组DNADNA的产物，可以在逆转录之前的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的使用扩增级的DNaseDNase对对RNARNA进行处理以除去沾染的进行处理以除去沾染的 DNA DNA。减少基因组减少基因组DNADNA污染污染 为了将扩增的为了将扩增的cDNAcDNA同沾染的基因组同沾染的基因组DNADNA扩增产物分开，扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于c cDNADNA的的PCRPCR产物会比来源于沾染的基因组产物会比来源于沾染的基因组DNADNA的产物短。的产物短。另外对每个另外对每个RNARNA模板进行一个无逆转录的对照实验，模板进行一个无逆转录的对照实验，以 确 定 一 个 给 定 片 段 是 来 自 基 因 组以 确 定 一 个 给 定 片 段 是 来 自 基 因 组 D N AD N A 还 是还 是 cDNAcDNA。问题问题1 1：关于：关于RT-PCRRT-PCR假阴性问题假阴性问题 原因原因1.1.仪器因素仪器因素2.2.试剂质量试剂质量3.3.RNARNA降解或起始量少降解或起始量少4.4.操作人员素质操作人员素质5.5.目的基因在组织中不目的基因在组织中不 表达或表达量低表达或表达量低对对策策1.1.离心机、离心机、PCRPCR仪进行验证仪进行验证2.2.选用高质量选用高质量PCRPCR相关试剂相关试剂3.3.分离无污染、高质量的分离无污染、高质量的RNARNA。4.4.严格遵守操作规程严格遵守操作规程5.5.尝试其它组织尝试其它组织问题问题2 2：非特异性扩增：非特异性扩增非特异性扩增非特异性扩增1.1.RNARNA中有内源或外源中有内源或外源DNADNA污染污染2.2.引物和模板非特异性引物和模板非特异性退火退火3.3.基因特异性引物设计基因特异性引物设计较差较差4.4.形成引物二聚体形成引物二聚体5.5.镁离子浓度太高镁离子浓度太高 原因原因对对策策1.1.用扩增级用扩增级DNase1DNase1处理处理RNA,RNA,使用抗气雾剂的吸头使用抗气雾剂的吸头2.2.cDNAcDNA合成中使用基因特异合成中使用基因特异性引物，使用递减性引物，使用递减PCRPCR3.3.遵循用于扩增引物设计的遵循用于扩增引物设计的同样原则同样原则4.4.设计在设计在33端没有互补序端没有互补序列的引物列的引物5.5.优化镁离子浓度优化镁离子浓度问题问题3 3：弥散：弥散弥弥 散散 原因原因1.1.cDNAcDNA第一链产物的含第一链产物的含量过高量过高2.2.DNaseDNase降解降解DNADNA产生的产生的寡核苷酸的非特异性寡核苷酸的非特异性扩增扩增3.3.PCRPCR反应中引物过多反应中引物过多4.4.循环数过多循环数过多5.5.退火温度过低退火温度过低对对策策1.1.常规常规PCRPCR步骤中减少模板步骤中减少模板cDNAcDNA的量的量2.2.提取高质量提取高质量RNARNA，防止被防止被DNADNA污染污染3.3.减少引物的用量减少引物的用量4.4.优化优化PCRPCR反应条件，减少反应条件，减少PCRPCR的循环次数的循环次数5.5.提高退火温度，防止非特提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸异性的起始及延伸Thank youThank you