参与DNA复制的酶类及DNA复制的调控(论文资料).ppt

第三章 参与DNA复制的酶类及DNA复制的调控 第一节 参与DNA复制的酶类 DNA复制过程非常复杂，至少有20多种酶与蛋白质参与。 一、DNA聚合酶(DNA polymerase)(一)作用机理 DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸合成DNA，即催化前一个脱氧核苷酸3OH与后一个脱氧核苷酸5P之间形成3,5-磷酸二酯键的反应，从而延长DNA链，链延伸方向为53，添加脱氧核苷酸的种类按碱基互补原则由模板DNA决定。 DNA聚合酶需要互补于DNA模板上的一小段RNA作引物，由引物提供DNA合成时需要的第一个3OH。因此DNA聚合酶需要的条件包括4种dNTP底物、Mg2、模板DNA和引物（图3-1）。,图3-1 DNA聚合酶的催化作用,DNA聚合酶与3OH端周围的单链DNA模板结合， 若进入的脱氧核苷酸的碱基与模板配对，该底物则结合到酶的三磷酸结合部位上。 在聚合酶催化下，引物链的3OH对底物的5P进行亲核攻击，释出焦磷酸根，形成磷酸二酯键，新生链由此延长一个核苷酸，酶沿着模板链向前移动一个核苷酸距离。 如此重复，直至酶到达模板终点。在体内释放的焦磷酸被焦磷酸酶水解，使反应平衡趋向DNA合成.,2005年12月Science报道了DNA聚合酶高保真机理的新发现。高保真聚合酶除具有广为人知的校正功能外,最近实验进一步表明, 由不能及时校正或难于纠正的错配碱基引发“关闭” DNA聚合反应的效应, 同样保证了DNA聚合反应终产物纯度。 高保真聚合酶这一“关闭” DNA聚合反应的能力, 促成其与耐外切酶消化3末端敏感区碱基特异性引物共同构成一个SNP敏感性纳米级复合分子“开/关”，高保真聚合酶分子中相距三纳米聚合中心和3端敏感区 5端敏感区外切酶酶解中心则既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的效能:对配对的引物，则直接在该酶聚合中心进行聚合反应，即“开”的效应；,而对于3 末端敏感区错配的引物，则从该酶聚合中心转移至3末端敏感区 5 末端敏感区外切酶酶解中心，由于引物修饰了3 末端敏感区耐外切酶的特点，继而出现了一种长时间无酶解产物的酶解过程，最后因酶聚合中心空转而“关”闭DNA聚合反应，即“关”的效应。 这一新的复合分子“开/关”在很大程度上满足了后基因时代对SNP分析的要求。该SNP分子开关的应用, 使基因诊断提高到单碱基水平。同时, 利用该方法通过SNP对基因组扫描, 在单基因遗传病病因研究及法医学鉴定上具有很强的理论和实用价值。,2006年7月Nature报道新发现突变相关的DNA聚合酶(Pol)可能导致DNA复制保真度下降而参与突变形成。除人细胞中已知的5种Pol，Pol、，Pol、的复制保真度很低。可能在遗传不稳定形成中有作用。近两年来，据原核和低等真核细胞复制后修复(PRR)途径的研究成果，在人细胞中克隆了5个新的Pol:Pol 、和Rev1编码蛋白。 大肠杆菌SOS反应中的非定标性突变的发生与dinB基因有关。DinB蛋白有Pol活性(Pol )，无35校读功能。高表达时可导致非定标性突变明显升高达上千倍。无损伤模板掺入错误率达10-310-4；大肠杆菌跨损伤DNA合成依赖于UmuD2C复合体，其中介导的途径通常是易误性的，它的突变引起诱发突变频率的抑制。,UmuD2C复合体也具有Pol活性(称为Pol V)。它在损伤或未损伤DNA模板皆表现为高度易误性，能有效跨越DNA上无碱基部位(abasic site)并优先插入一个腺嘌呤。 酿酒酵母PRR途径有三个独立旁路(一个易误，两个无误)。基因REV1、REV3和REV7与易误性旁路有关。其中Rev3和Rev7蛋白构成Pol，Rev1蛋白为有DNA模板指导的dCMP转移酶活性，因此也是一种Pol。 在芽生酵母中的两条无误PRR途径依赖RAD5和RAD30基因。RAD30基因与大肠杆菌的DinB和UmuC和酿酒酵母中的Rev1基因同源。它可在DNA合成时在嘧啶二聚体的对面正确掺入两个腺嘌呤。它是一个保真度很低的Pol，其掺入差错率高达10-2到10-3。,这些与突变形成密切相关的Pol在人细胞中都找到了相应的同源物基因，与酵母中的REV3同源的hREV3编码的Pol以及与Rev1同源的基因；与大肠杆菌中的DinB和酵母RAD30同源的hDinB基因编码Pol；与大肠杆菌UmuC和酵母RAD30同源的hRAD30基因编码Pol、另一与酵母RAD30同源的hRAD30B编码的Pol。已证明着色性干皮病变型(XPV)系Po1的突变所致。 这些新发现的Pol，可能与诱发的细胞遗传不稳定的形成有关。我们证明用反义核酸技术阻断Pol表达的细胞系MNNG诱发的非定标性突变的频率减低。,(二)原核生物DNA聚合酶 在大肠杆菌体内发现了三类DNA聚合酶，根据发现时间顺序分别命名为DNA聚合酶、。 1.DNA聚合酶I 大肠杆菌DNA聚合酶I是第一个被鉴定的DNA聚合酶，它由polA基因座编码，是一个103kD的单链多肽。每个大肠杆菌细胞中约有400个分子DNA聚合酶I。 当底物和模板存在时，聚合酶I可使脱氧核糖核苷酸依次加到具有3-OH末端的多核苷酸链上。它的催化需要引物链（DNA或RNA链）的存在。在37条件下，每分子DNA聚合酶I每分钟中催化约1000个核苷酸的聚合。,DNA聚合酶I是一个多功能酶，它可以催化以下的反应： （1）DNA链沿53方向延长（DNA聚合酶活性）。 （2）从3端水解DNA链（35核酸外切酶活性）。 （3）从5端水解DNA链（53核酸外切酶活性）。 （4）具有很强的校对功能（ 35核酸外切酶活性）。 （5）有切口平移功能（53核酸外切酶活性）。 用蛋白水解酶将DNA聚合酶I作有限水解，可得到分子量68kD和36kD的两个片段。,较大的断裂产物（68kD）叫Klenow片段，在体外它可催化DNA的合成反应，Klenow片段有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，两种活性分别处于片段的不同区域。 C端的2/3片段具有聚合酶活性，N端的13片段有核酸外切酶活性，在蛋白质中，两个活性位点的距离为3nm，表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。 小片段（35kD）有53核酸外切酶活性，可以切除少量的核苷酸，一次最多切除10 个硷基。,该酶在切除由紫外线照射而形成嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA的半不连续合成中，冈崎片段5-端RNA引物的切除可能也依赖于该外切酶，小亚基的外切酶活性和大亚基的聚合校对功能协同作用，使DNA聚合酶I在体外具有从切口处起始复制的独特能力，而其他DNA聚合酶不具备这种能力。 在双链DNA的磷酸二酯键断裂处，DNA聚合酶I可延伸3末端，合成新的DNA片段后，DNA聚合酶I可置换双螺旋中已有的同源链。,置换出的同源链被53核酸外切酶降解。除部分片段被新合成的材料取代且缺口位置沿双螺旋移动外，DNA性质没有任何改变。 该反应在实践中很有意义，体外的切口移位是在DNA分子上引入放射性标记核苷酸的重要技术，在体内，53聚合酶合成活性和35核酸外切酶活性主要用来填充DNA双链中短的单链区域，复制过程中或从DNA中切除受损的硷基后会产生这些单链区域。,2.DNA聚合酶II DNA聚合酶II是一条分子量为120KD的多肽链。该酶活性很低，只有DNA聚合酶I的5。它也以4种脱氧核苷酸为底物，按53方向合成DNA。DNA聚合酶II具有35核酸外切酶活性，但无53外切酶活性。它在DNA修复中起一定作用。 3.DNA聚合酶III 尽管细菌中存在大量的DNA聚合酶I，但它并不是复制的主要酶。在polA的突变型中，复制仍可继续进行。 目前，DNA聚合酶III（PolIII）被认为是真正负责大肠杆菌细胞内DNA合成的复制酶。 DNA聚合酶III是多个亚基组成的蛋白质，细胞中含量很少，在每个细胞中只有1020个拷贝的全酶。 PolIII全酶由、10种不同的亚基组成，至少含3种重要的酶活性。,核心聚合酶（core polymerase）由、三种亚基组成，其中亚基分子量为130kD，由dnaE编码，具有53的聚合活性，每秒可以合成8个核苷酸。 亚基具有35核酸外切酶的校对功能，由dnaQ编码合成。在体内亚基基本功能是保证复制的忠实性，这可由dnaQ突变体的表型所证实，在细菌株中突变发生的概率增加了1000倍。亚基常与亚基形成一个紧密的1：l复合物，协同发挥功能。 细胞中大约有40分子核心酶，其中只有一半被组装到全酶中,核心酶活性较低，以大约每秒20个核苷酸的速度合成DNA。,二聚体：亚基是以二聚体的形式存在，在复制过程中二聚体环绕着DNA，并能在DNA上自由滑动，构成一个滑动钳。 滑动钳可把全酶束缚在DNA模板上，从而保证高度的进行性，当pol结合钳时，全酶的进行性可从每次聚合10个核苷酸提高到每次聚合50000个核苷酸，聚合反应速度从每秒20个核苷酸上升到每秒750个核苷酸，因此钳的存在对大肠杆菌染色体高效复制是十分重要的，亚基可以很容易从全酶中脱离。 与核心酶相比，在细胞中亚基含量很丰富，大约每个细胞中含300个二聚体。,复合物：复合物（complex）是滑动钳的载体,可帮助滑动钳结合到DNA上。复合物含有5个不同亚基，形成一种化学计量为21111的结构。和亚基是由不同基因编码产生的不同蛋白质。复合物有依赖DNA的ATP酶活性。 二聚体自己并不能组装到DNA上 ，它是通过复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上。 DNA聚合酶、均具有53聚合酶活性和35核酸外切酶活性，因此在合成DNA时，能识别和切除不配对的引物末端，起着严格校对作用，以保证复制的真实性。,DNA聚合酶的特别之处在于它具有53外切酶活性。这种活性只作用于双链DNA，从5-端切除寡核苷酸。由于它能跳过几个核苷酸起作用，因此能切除由紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体，参与DNA损伤的修复。 DNA聚合酶能催化切口平移和链置换反应,双链DNA的一条链发生断裂，出现切口，DNA聚合酶与切口结合，其53外切酶活性与聚合作用同时发生。即它一边催化3-OH与三磷酸核苷酸产生聚合反应，一边在5端逐一水解核苷酸，切口就沿着DNA链从53方向移动。这种移动称为切口平移（nick translation）（图3-2）。,图3-2 DNA聚合酶I的切口平移,如果选择合适的实验条件，使聚合作用发生在单链切口处而不同时出现53外切酶活性，这种延伸中的链就置换了亲链，即所谓链置换反应，这被认为是遗传重组机制中的一个重复步骤。 在迄今所知的大肠杆菌聚合酶中，唯有DNA pol能独立地进行链置换反应。其它链置换反应中，需要辅助蛋白，并裂解ATP为解螺旋提供能量。,利用切口平移反应，可获得标记的DNA探针。 将DNA聚合酶、带有切口的双链DNA分子以及放射性标记的三磷酸脱氧核糖核苷一起反应，可合成带有放射性标记的DNA探针，而同时降解未被标记的DNA。 DNA聚合酶在DNA损伤时表达增加，还参与SOS修复反应，能以损伤的DNA链为模板合成新生链。这种特性易于造成DNA的永久突变。 表3-1总结了原核生物三种DNA聚合酶的特性和功能。,表3-1 原核生物DNA聚合酶性质比较,(三)真核生物DNA聚合酶 真核生物中现已发现五种DNA聚合酶，分别命名为.等。 它们的基本性质与原核生物DNA聚合酶相似，其活性依赖于带有3OH的引物、DNA模板和4种dNTP。表3-2列出了真核生物DNA聚合酶的基本特性和功能。,表3-2 真核生物DNA聚合酶性质总结,二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白 利用SV40体外复制系统，已相继鉴定出一些真核生物DNA聚合酶附属蛋白。主要有增殖细胞核抗原（PCNA），复制因子C（RFC）、识别引物的PRP1和PRP2蛋白以及聚合酶相关因子（AAF）等。 1.PCNA是DNApol的附属蛋白 能极大地促进DNApol的合成活性。其分子量为36103。已在人、大鼠、小鼠、果蝇、酵母等生物中克隆了PCNA的基因。它们的氨基酸序列有较高同原性，结构也相当保守。 PCNA可能是通过与RFC和ATP自由结合到引物末端，或通过ATP非依赖方式滑动到引物末端而增强DNApol的催化效率。最近有研究表明，PCNA在DNA的切除修复中起一定作用。,2.RFC是一个多亚基复合物 因细胞类型的不同，RFC亚基数也从3个到7个不等。140103的大亚基识别DNA模板引物，40103小亚基结合ATP,RFC在体外能增强DNApol和的活性。RFC结合到引物末端并通过DNA刺激的ATPase活性与PCNA结合形成一个引物识别复合物。此复合物对DNApol的亲和力高而与DNApol的亲和力低。 3.PRP1和PRP2是两个引物识别蛋白 分子量分别为36103和43103，它们降低引物末端的Km，使DNApol与模板引物末端的亲和力增加2030倍，从而促进DNApol的活性。 4.AAF是模板亲和蛋白 AAF由两个亚基组成，分子量分别为132103和44103。它是一种模板亲和蛋白，有促进DNApol引发酶利用未经引发的模板，作为一种DNApol引发酶的活化因子，AAF辅助它们在后随链上的催化活性。,三、DNA引物酶 E-coli的引物酶由DnaG基因编码，合成的引物是pppAC（N）7-10。真核生物引物酶是由48X103和58X103二个亚基组成的异源二聚体，与DNApol形成紧密复合物，合成的引物为pppA（N）10，其特点是缓慢起始，快速聚合及在DNApol起始合成前准确终止。 四、DNA连接酶 DNA连接酶催化冈崎片段间磷酸二酯键的形成,不同于聚合酶的催化反应。当DNA双链中的一条单链是完整的，DNA连接酶能催化另一条链的相邻5P与3OH之间形成3,5-磷酸二酯键，且偶联NAD（原核生物）或ATP（真核生物）的水解（图 3-3）。,图3-3 连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口,DNA连接酶除了可以闭合双链DNA中的单链切口，还可闭合RNADNA杂交体双链中的单链切口，但不能闭合双链RNA中的单链切口。在有过量ATP存在时，T4噬菌体连接酶可连接平头双链DNA，但大肠杆菌连接酶不能催化这种连接反应。 原核生物大多只有一种形式连接酶，真核生物则有多种形式连接酶。不同形式连接酶的催化特性，对底物及ATP亲和力以及对细胞增殖的作用均有所不同。 DNA连接酶的催化性质，决定了该酶在DNA复制中的重要地位，它的作用还涉及到DNA修复和重组以及DNA重组技术。,五、与DNA解旋和解链有关的酶 在双链DNA复制过程中，由于复制叉的移动速度快（原核生物为1000bp/s,真核生物为100bp/s），DNA双螺旋不断解开，在复制叉前方的DNA双链会出现过度的正超螺旋甚至打结现象，阻碍DNA的继续复制，生物体依靠一系列DNA解旋解链酶，不断消除产生的正超螺旋，保证复制的进行。 (一)DNA螺旋酶（DNA helicase） 也称DNA解旋蛋白（DNA unwinding protein）。它的作用是催化双螺旋DNA的解旋和解链。该过程需水解ATP提供能量（打开一个AT对约需5KJ.mol-1，打开一个GC对约需21KJ.mol-1）。,从大肠杆菌分离得到数种DNA螺旋酶，分别称为螺旋酶、和rep蛋白等,后三者与大肠杆菌DNA复制有关。 在复制过程中，螺旋酶、沿着后随链模板，从53方向移动，促使复制叉向前延伸，而rep蛋白是沿着前导链模板，以35方向向前移动，促进双链不断解开。 在真核生物中也发现多种螺旋酶，如从小牛胸腺中分离到8种螺旋酶，但有关其作用机制及其在DNA复制中所起的确切作用仍不清楚。 现在正试图克隆和表达螺旋酶的基因，分析它的结构并研究其是否细胞存活所必需，研究其是否受细胞周期调控以及在复制叉模型中的作用。,(二)拓扑异构酶（Topo merase） 在原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶（和）。原核生物中与复制有关的主要是Topo，又称DNA回旋酶（DNA gyrase），原核生物Topo可能与转录有关。 DNA回旋酶的作用是在水解ATP的同时使松驰态环状DNA转变为负超螺旋DNA。这种作用很复杂，涉及三个步骤： （1）DNA回旋酶首先与DNA结合，并使环状DNA扭曲而形成一“右手结”结构。这个作用是形成一个稳定的正超螺旋（以“”表示），同时又引入一个负超螺旋（以“”表示）。,（2）然后DNA回旋酶在右手结的背后打断双链DNA，并穿到另一条链前面，这样就将右手性正超螺旋变为左手性负超螺旋。 （3）最后断点再连接起来。这个过程需ATP水解供能；引入的负超螺旋能使打开碱基对所需的能量降低约4.1KJ.mol-1,利于DNA解链复制（图3-4） 。,图3-4 拓扑异构酶的催化作用,真核生物中Topo和均与复制有关。Topo不需消耗ATP，其酪氨酸残基能与DNA 3P基团形成共价结合的中间产物，它能使负或正超螺旋变为松驰态。 Topo需要ATP供能，它不仅参与DNA复制，还促进两个子代分子分离。 真核生物Topo无论在细胞增殖期还是在静止期，都维持在较高水平，与细胞生长速率无关。而Topo水平在细胞增殖期比在细胞静止期高100倍以上。,令人感兴趣的是Topo在肿瘤细胞水平很高，与其增殖潜能相平行。 有人从中得到启发，正在研究Topo的抑制剂，观察它在肿瘤治疗中的效果。 Topo与Topo的另一不同之处在于它独特地沿着染色体分布，与染色体结构、压缩及核基质组成有关。,(三)单链结合蛋白(Single-strand Binding protein,SSB） SSB对单链DNA的亲和力极高，但几乎没有序列特异性。它们的基本特征是结合单链DNA，刺激DNA聚合酶的活化并与其他复制蛋白作用形成复合物等。 SSB常组成同亚基多聚体，它与DNA的结合呈现协同效应。 最早研究得较为清楚的是E-coli SSB蛋白以及T4噬菌体基因32产物。,在哺乳动物细胞中分离的单链结合蛋白，命名为复制因子A（RFA）。 RFA由分子量分别为70KD、32-34KD和11-14KD的三个不同亚基组成。其中76KD的大亚基具有单链DNA结合活性，还能促进DNApol和的聚合作用，32KD的亚基可被CDK2激酶磷酸化，与细胞周期有关。 RFA不仅在DNA复制时，起始解链中起作用，还促进DNA链的延长。图3-5总结了与DNA复制有关的酶在大肠杆菌复制叉中的作用。,图3-5 各种因子在DNA复制中的作用,第二节 DNA复制的调控 DNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。 “细胞分裂周期” 也称“细胞周期” ，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个细胞所经历的全过程，通常可分为若干阶段，即G1期、S期、G2期和M期。 细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在S期完成其遗传物质染色体DNA的复制，在G2期进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确性，然后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。,原核细胞DNA复制完成后即发生细胞分裂，而真核细胞中DNA复制只发生在细胞周期中特定时期，细胞周期合成期-S期。 通常在一个细胞周期中，DNA必须也只能复制一次。科学家发现，细胞内有一个调控机构，使细胞周期能有条不紊地依次进行。细胞周期各期的转变均受某些基因产物的调节，其中有细胞周期蛋白家族（Cyclins）、细胞周期依赖性蛋白激酶家族（Cyclin Dependent protein Kinases,CDKs）和其它一些蛋白质。,细胞能否分裂最主要决定因素是其能否进入S期，即是否进行DNA复制。 细胞周期调控主要发生在从G1S和从G2M这二个关键点上，调节这二个关键点的事件都涉及Cyclin和CDK的作用。通过蛋白激酶对多种蛋白质特殊调节位点的磷酸化而激活或抑制它们的活性，以适应其功能需要。 细胞周期调控有关的蛋白激酶都是由调节亚基和催化亚基组成的异源二聚体。调节亚基称为细胞周期蛋白（Cyclin）,其浓度随细胞周期而变化；催化亚基又称细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）。同一CDK可与不同的周期蛋白相连接以决定不同的蛋白质被磷酸化。,哺乳动物中，调控DNA合成起始的周期蛋白和CDK通常为周期蛋白E或A及与之相关联的CDK2，而调节有丝分裂起始的常是周期蛋白A和B及与之相关联的激酶CDK2。 爪蛙卵提取物实验发现，DNA起始复制必须有CDK2和周期蛋白E或A的存在。 在鼠成纤维细胞中，周期蛋白E的过度表达导致细胞很快从G1期进入S期。 以上证实CDK2及周期蛋白E在调控DNA复制起始中的作用。,酵母细胞中发现一类S期启动蛋白（S-phase promoting factor，SPF），它由细胞周期蛋白依赖激酶CDK28和周期蛋白G1组成。 CDK28蛋白由CDK28基因编码，在温度敏感突变株中，CDK28失活，细胞不能进入S期，DNA不能合成。编码G1蛋白的基因有三个：cln1、cln2、cln3。 利用基因敲除技术（gene knockout）缺失三个cln基因中的任一个，细胞仍能存活，而同时缺失三个cln基因，细胞只能停留在G1期，不能起始DNA合成。,最近发现有更多的周期蛋白和CDK参与细胞周期中DNA复制的调控。 如周期蛋白D及与之相关的CDk4在G1期结束时达到高峰，而在S期开始时即下降，提示它们在G1S期转换中起作用（表3-3）。,表3-3 酵母细胞及哺乳动物中发现的CDk和周期蛋白,2001年度诺贝尔生理学医学奖获得者美英科学家，因为发现了细胞周期关键调节因子细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK）和周期蛋白（cyclin）。,2001年诺贝尔生理学医学奖得主（依次为利兰哈特韦尔提莫西.亨特保罗.纳斯）,细胞周期的准确调控对生物的生存、繁殖、发育和遗传均是十分重要的。简单生物调控细胞周期主要是为适应自然环境，以便根据环境状况调节繁殖速度，以保证物种繁衍。复杂生物细胞则需面对来自自然环境和其他细胞、组织的信号，并作出正确的应答，以保证组织、器官和个体的形成、生长以及创伤愈合等过程能正常进行，因而需要更为精细的细胞周期调控机制。 早期研究集中在细胞周期的特性上，主要发现了细胞周期有序性，并发现在G1晚期内有一个关键的限制点，也称R点:通过R点的细胞将不可逆地进入S期直至完成细胞分裂，否则则可因环境或内部的不利变化而继续留在G1期。,为认识细胞周期调控分子机制，科学家研究了各种实验材料，包括微生物、软体动物、昆虫、两栖动物和哺乳类动物等。 哈特韦尔博士在1970年以单细胞生物面包酵母（也称芽殖酵母）为材料，利用遗传学方法，先后发现上百个突变后导致细胞周期异常的基因。其中一个被称作CDC28基因，对细胞周期启动，即细胞能否通过R点（在酵母中被称为启动点）很关键，因此也被称作启动基因。,纳斯博士则以裂殖酵母为实验材料，发现了功能及编码蛋白均与CDC28非常相似的CDC2基因，并从高等生物中也克隆到了类似基因，从而说明细胞周期调节机制在进化过程中是保守的:从酵母到人，其细胞周期进行都由CDC2基因控制。 后来这类基因被统称作CDK基因，为周期蛋白依赖性蛋白激酶的英文缩写。有趣的是，尽管酵母细胞中只有一个CDK基因，高等生物中却有多个，体现了进化程度不同的物种对调控系统复杂性和精确性的不同需求。,亨特从海胆中发现了CDK的“伴侣”-周期蛋白。这类蛋白因其含量在细胞周期中呈周期性变化而被发现并得名。周期蛋白与CDK蛋白形成复合物，使CDK发挥激酶活性。有活性的激酶把磷酸基联到特定蛋白质上，使后者性质发生变化，从而又影响其下游蛋白，如此实现调节功能。 酵母细胞只有一个CDK基因，但有若干种周期蛋白基因。不同周期蛋白在不同时期被合成出来，然后又被适时 地降解。这样，CDK激酶活性就像引擎中汽缸一样被依次点燃，从而驱动细胞周期周而复始地“转动”，细胞不断增殖。 高等生物含有多个CDK，每种CDK可与不同周期蛋白结合，反之亦然。如此复杂的搭配可能会增加在同种细胞内的调节精度，也可能用于在不同组织的细胞中实现不同的调节，而有的CDK复合物则参与调节其他生命活动，如神经细胞分化等。除周期蛋白外，CDK活性还受到磷酸化、去磷酸化、CDK抑制蛋白等的调节。细胞周期调控的复杂性，由此可见一斑。,细胞周期与多种人类疾病相关，其中最重要的莫过于与肿瘤和癌症的关系。肿瘤和癌症的主要原因是细胞周期失调后导致的细胞无限制增殖。 从分子水平看，由于基因突变致使细胞周期促进因子（或称“癌蛋白）不恰当的活化，和或抑制因子（即“抑癌蛋白”）失活，造成细胞周期调节失控。其中，破坏R点正常控制、由癌蛋白使细胞同期调控系统总得到“增殖”指令，导致肿瘤细胞大量增殖。所以，阻止癌细胞分裂即可达到抑制其恶性生长甚至将其杀灭的目的。实际上多数肿瘤化疗药物均是细胞周期抑制剂，但缺点是它们“良莠不分”，也抑制正常细胞。 对细胞周期分子机制的研究，不仅使我们能深刻认识这一重要生命活动的本质，还可能通过针对性的设计和筛选，开发出更专一、更有效的治疗药物及治疗方法。深入的研究也将使相关疾病病因的基因诊断和针对性基因治疗成为可能。,一、复制起始位点的选择 真核细胞基因组DNA有多个复制起始位点，是否每次复制时都起用所有起始位点，要视细胞分裂的快慢、细胞周期的长短，特别是S期的长短。 在动物发育过程中，细胞周期中的S期可以短至几分钟，或长至几个小时。在胚胎期，细胞分裂很快，S期很短，基因组复制在几分钟内完成，起用复制起始位点很多。 在成熟组织中，细胞分裂较慢，S期较长，基因组复制在几个小时内完成，起用复制起始位点较少。在蟾蜍和果蝇的发育过程中，在中囊胚期转变之前，DNA复制起始位点没有特异性；在中囊胚期转变之后，DNA复制有选择地在某些DNA复制起始位点起始。,有研究表明，真核细胞Pre-RC在许多复制起始位点上组装，但是有Pre-RC组装的复制起始位点并不一定起始DNA复制。 也就是说，有Pre-RC组装的复制起始位点数目比实际上发挥起始DNA复制作用的复制起始位点数目大。这些现象表明真核生物体内存在调控复制起始位点的机制。 复制起始位点的调控主要表现在两个方面： 1.调控启动DNA复制起点的多少。 2.调控在哪些复制起点上起始DNA的复制。,所谓DNA复制起点有两个概念，即遗传性（或结构性）和功能性。遗传性起点是一种DNA顺式作用元件，可使环形DNA自主复制。功能性起点是染色体上确实起始DNA复制的位点。 在原核生物基因组中，只有一个DNA顺式作用元件与复制起始蛋白相互作用，成为复制的功能性起点。 真核生物基因组比原核生物基因组大得多，具有很多遗传性起点，但并不是每个遗传性复制起点都作为功能性起点起始DNA复制。在真核生物中，有多种因素参与决定遗传性复制起点起始DNA复制。,酵母复制起点叫自主复制序列（ARS）。有些可在体外使环状DNA复制的ARS，在酵母染色体中并不起始DNA复制。如在酵母3号染色体中有14个ARS元件，但具有起始复制功能的只有6个，其它ARS都不能起始DNA复制。功能性复制起点在染色体内的位置改变，可使本身不能起始DNA复制。 科学家发现，将裂殖酵母3号染色体中Ura4基因的强复制起点缺失后，其附近的弱复制起点可成为强复制起点。这些实验结果说明ARS元件所处的环境可控制它们的状态。,到目前为止，高等真核生物中还未确定是否存在遗传性DNA复制起点序列特征，但功能性复制起点的确存在。目前对高等真核生物中功能性复制起点的性质了解也不多。为了解多细胞生物复制起点的特征。人们开始重视研究细胞核或染色体结构对复制起始的调控。 近来，人们发现将G1期完整的CHO细胞核和蟾蜍卵细胞提取物共同孵育后，起始DNA复制的复制起点不是随机的，与正常培养的CHO细胞一样。当损坏的细胞核或裸DNA代替G1期完整的细胞核后，起始DNA复制的复制起点是随机的。说明在真核生物中细胞核和染色体结构可以调节DNA复制的起始。 细胞核和染色体结构调节DNA复制的机制，将成为研究的热点。,二、DNA在一个细胞周期中只复制一次的调控 真核基因组中有很多复制子，每个复制子的复制起点在一个细胞周期中仅被激活一次。这种调控机制的关键问题是机体是如何识别哪些复制起始位点在一个细胞周期中已起始复制过DNA，有哪些蛋白组分参与？ 1.复制的允许机制 蟾蜍卵细胞复制系统是了解这些蛋白组分的很好系统，该系统中的DNA只发生一次复制。 蟾蜍卵细胞包含DNA复制所需要的所有蛋白质组分，在受精后的几个小时里，它们可以进行11次分裂，而没有新基因的表达。 将外源性细胞核注射到蟾蜍卵细胞内后，外源性细胞核内DNA只发生一次DNA复制，图3-6概括了该系统的特征。,图 3-6 蟾蜍卵细胞复制系统证明,如果卵细胞内的蛋白合成被阻断，而且外源性细胞核膜完整，DNA不能再次复制；如果卵细胞象正常细胞一样分裂，蛋白质合成正常进行，外源性细胞核膜被降解，DNA可以再次复制。 这提示细胞核内存在一种或多种DNA复制必需的蛋白质，它们在一个细胞周期中一次复制后被用完或被降解。这种（些）蛋白质在细胞浆里还有很多，但它们不能进入细胞核，只有当细胞核膜降解时才能进入细胞核，这些蛋白质被称为“允许因子”（licensing factor）。 这种机制可以防止复制在一个细胞周期里再次发生，图7-7简单解释了“允许因子”防止复制再次发生的机制。,图3-7“允许因子”防止复制再次发生的机制,在复制前，细胞核内存在有活性的“允许因子”，基因组复制一次后可以使允许因子全部失活或降解，细胞质中的“允许因子”不能进入细胞核。允许因子只有在细胞分裂期（核膜降解时），才能进入细胞核。细胞核内再出现允许因子后，才能进行基因组复制。 啤酒酵母中的MCM2,3,5复合物是一种允许因子，该复合物是复制必需的，且只有在分裂期才能进入细胞核。 动物细胞在整个细胞周期中都有MCM2,3,5复合物，它可以与基因组DNA发生周期性结合，提示动物细胞中的MCM2,3,5可能是允许因子的一种。 研究表明，将MCM2,3,5突变后，确实能够阻止复制起始；而将“允许因子”抑制物突变后，可导致产生过量的DNA。,2.蛋白激酶的调控 两种蛋白激酶，CDK（cyclin dependent kinases） 和Cdc7-Dbf4激酶，是真核生物DNA复制起始绝对必需的。这两种激酶在起始反应的不同阶段发挥作用，并有不同的底物。 近来用有爪蟾蜍和芽殖酵母研究表明，还有蛋白激酶A和蛋白磷酸酶2A等也参与复制的起始。 在真核生物细胞每个细胞周期中，基因组复制且仅复制一次，这是在精确调控机制下完成。 该机制使细胞有两种状态：一种是多种参与DNA复制的蛋白组装成复制起始复合物，但不启动复制起始；二是CDK激活复制起始复合物，使细胞进入复制起始状态。,CDK在细胞从G1期向S期过渡期间，具有很高活性。该活性不仅可以启动复制起始，还可以防止同一细胞周期中已复制基因组DNA再次发生复制。 这都是CDK对参与DNA复制起始的蛋白进行磷酸化的结果。这种由CDK驱动的“复制开关”为基因组DNA在同一细胞周期复制且仅复制一次提供了一种完美的机制。,首先证明CDK能够防止DNA复制在同一细胞周期再次发生的证据来自对裂殖酵母遗传学的实验研究。 基因敲除Cdc13（一种M期细胞周期性蛋白）的基因后，细胞可以连续发生多次DNA复制，但不能进行细胞分裂。 在裂殖酵母中表达CDK的抑制物，可以获得同样的结果。M期细胞周期性蛋白缺陷型的果蝇，在同一细胞周期中，也能够发生多次DNA的复制。这些实验结果都提示，CDK可以抑制DNA复制在G2和M期的发生。,在啤酒酵母中，CDK可通过抑制复制起始复合物的组装抑制 复制重复发生。 在G2/M期抑制CDK活性，发现DNaseI足迹具有DNA复制起始前状态的特征。相反，如果在G1期表达B型细胞周期性蛋白Clb2，DNA复制起始被抑制，DNaseI足迹不具有DNA复制起始前状态。 染色体交联试验发现，G2/M期高CDK活性可阻止MCMp与DNA复制起始位点相互作用。与这些实验结果一致，蟾蜍Cdk2-cyclinE可以抑制Mcm3与染色体复制起始位点相结合。 这些实验结果说明CDK可抑制复制起始复合物在复制起始位点上组装。,为了认识CDK防止复制重复发生机制，寻找CDK关键底物很 有必要。CDK可抑制MCMp蛋白组装，这提示CDK参与MCMp组装的蛋白，包括ORC、Cdc6/Cdc18以及MCMp本身都可能是CDK的潜在底物。到目前为止，有直接证据表明Cdc6和Cdc18是CDK底物。 Cdc6/Cdc18在复制起始复合物组装过程中起重要作用。它们可与复制起始位点相互作用，并且是MCMp结合到复制起始位点必需的。 在裂殖酵母中高水平表达Cdc18可引起DNA复制的重复发生。CDK对Cdc6/Cdc18磷酸化后，可负调节它们的功能，防止在同一细胞周期中复制的再次发生。,这种作用首先在裂殖酵母实验中发现。Cdc18N末端含有CDK的磷酸化位点，将它们缺失突变后，可发现： 1.在体内Cdc18突变体比野生型Cdc18稳定得多 在裂殖酵母体内，Cdc18很不稳定，细胞进入S期后，被很快降解。CDK磷酸化位点缺失突变后，Cdc18半衰期可从大约5min延长至60min。 后来研究发现，CDK将Cdc18磷酸化后，可使其在蛋白酶体中被遍在蛋白化作用，并降解。 2.细胞基因组复制可以多次发生 这与高表达Cdc18的实验结果一致；在碑酒酵母中，用Cdc6进行实验，可取得同样结果。 由此可见，CDK对Cdc6/Cdc18的磷酸化可防止细胞染色体复制重复发生。,在人体中，CDK对Cdc6磷酸化也可抑制Cdc6的功能， 但机制与酵母中不同。在人体细胞，整个细胞周期中Cdc6都存在，但Cdc6在细胞内的分布随着细胞周期发生变化。 Cdc6在G1期，位于细胞核内，在S期开始后，它通过Crm1依赖的机制转运到细胞浆中。该过程和Cdc6磷酸化有关，因为缺失N端磷酸化位点的突变体在整个细胞周期中都在细胞核中。 在体外，Cdc6可以被Cdk2-cyclinA和Cdk2-cyclinE磷酸化，但在体内Cdc6可能更偏向于结合cyclinA。因为在人细胞核糖体表达cyclinA可以引起Cdc6快速从细胞核进入细胞浆。 CDK依赖的Cdc6重新分布是防止人基因组复制重复发生的机制之一。,CDK磷酸化MCMp，防止复制重复起始。CDK磷酸化Cdc6/ Cdc18对防止复制重复起始很重要，但不是唯一机制。CDK使MCMp磷酸化后，可抑制MCMp再组装到复制起点。 研究在MCMp缺失磷酸化位点后，细胞是否出现基因组重复复制的现象具有重要意义。,三、DNA复制的检查机制 检查点机制（checkpoint mechanism）也是调控DNA复制的重要机制之一。当基因组损伤或DNA合成受阻，干扰基因组正常复制过程时，检查点机制被激活。 起初，检查点是用来描述细胞监控的机制，这种机制可以延迟细胞分裂过程，直至DNA复制完成或损伤DNA被修复，从而协调细胞周期与DNA复制的正常完成。,随着对检查点机制的深入了解，发现检查点机制在 基因组受损时，不仅仅是引起细胞周期的延迟。 比如，在啤酒酵母中，检查点机制可引起许多基因转录，基因产物在DNA损伤修复过程中发挥作用。 因此可给检查点一个比较广泛的定义：检查点机制可以识别DNA损伤或DNA复制的阻断，通过复杂的多种信号转导途径维持基因组的完整性。,2000年7月 Cell 报道，发现G1期的检查点是一个复杂过程。正在分裂的细胞存在多个检查点，用来不让受损DNA进行复制及确保受损的染色体不发生凝集。G1期细胞 对DNA损伤有两步反应，首先是G1期快速停止,此过程不需p53; 然后是依赖于p53对细胞周期停止的维持。 原来一直认为当细胞受损伤时，首先是p53被ATM激酶磷酸化，再促进多个基因转录激活，如p21cip1, p21抑制cyclin E/CDK2复合物，进行G1期的抑制，但此过程通常要8个小时才能发生，而离子射线诱导的G1期停止几乎是立即完成的。 为了解开这个谜团，Agami,R等人构建了一个p53失活的细胞系，进行离子辐射刺激后，发现cyclinD1下调，这种下调是由cyclinD1本身的RXXL引起。在受到刺激后，cyclinD1被APC降解，释放出p21, p21即对cyclinE/CDK2复合物产生抑制，完成了早期快速抑制过程，而p53介导的p21上升看来是起后期维持作用。这个问题得到解决，但在检测DNA损伤的反应中，可能还有许多不为人知的事。,下面主要对两方面的检查点机制进行探讨： 1.DNA合成抑制所激活的检查点机制。 2.细胞S期辐射或化学物质所致DNA损伤激活的检查点机制。 人们对检查点机制的了解主要是来自酵母的遗传学和生物化学试验。随着研究逐步深入，人们发现许多参与检查点机制的蛋白在高等真核生物中是保守的。 在哺乳动物体内，如果检查机制不发挥作用，基因组会变得不稳定，而且增加癌的易感性。 先介绍两种酵母系统检查点机制的功能，然后再简单介绍一下哺乳动物细胞中的相关内容。,1.DNA合成被抑制所激活的检查点机制 羟基脲存在条件下，细胞进入S期后，在大多数复制起始位点上都可发生DNA复制起始，但由于核苷酸前体缺乏，复制叉在模板链停止移动。这种情况可激活S期的检查点机制。 检查点机制激活后，可对细胞产生多种效应：a.延迟分裂期染色体的分离；b.稳定复制出不完整的染色体，以保证核苷酸前体不缺乏时，能够使染色体复制正常完成；c.引起多种基因（例如核糖核苷酸还原酶基因）的表达，基因产物有助于恢复复制叉正常运动。,在裂殖酵母体内，rad1、rad3、rad9、rad17、rad26和hus1等6种基因的编码产物可能参与上述多种效应的产生。 在这6种基因中，不管哪种基因突变后，细胞对羟基脲高度敏感，DNA复制没完成就进入细胞分裂期。 在这些Rad蛋白中，SpRad3/ScMec1是PI3k激酶超家族的成员，该家族中还有DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)、ATM(ataxia telangectasia mutated:共济失调毛细血管扩张诱导)蛋白和ATR（ataxia telangectasia-and Rad3-related）蛋白等。,在这个蛋白激酶家族中，人们对DNA-PK了解得最清楚。DNA-PK是一种三亚基的丝/苏氨酸蛋白酶，是双链DNA断裂修复所必需。将DNA-PK与DNA断裂处结合后，DNA-PK激酶的活性可明显提高。 以此类推，SpRad3/ScMec1可能在酵母中直接参与停止复制叉的运动和DNA损伤的识别。 在哺乳动物中，ATM和ATR参与对DNA损伤的反应，但它们的酶学性质还不是很清楚。,缺失DNA聚合酶的裂殖酵母细胞，在羟基脲存在条件下, 发生细胞分裂，但染色体DNA复制不完整。 Cut5基因突变的细胞，也呈现同样表型,Cut5基因的编码产物参与DNA复制，但具体功能不清楚。 遗传实验发现4个编码产物参与复制的基因POL2、DPB11、ORC1、RFC5，是检查点机制所必需。,POL2基因编码的DNA聚合酶，它可结合在复制叉处，监视复制是否中断。DNA聚合酶有两个结构域，具有不同的功能；其N端具有聚合酶和核酸外切酶活性，该结构域不是酵母生存所必需的。 研究发现，其C端是细胞生存所必需的。C端结构域突变不仅降低DNA复制效率，而且使检查点机制的功能不能正常发挥。 在此情况下，羟基脲抑制DNA复制,引起核糖核苷酸还原酶基因不能表达以及细胞周期的延迟。将DPB11、ORC1和RFC5基因突变后，啤酒酵母也呈现出同样的表型。 这三个基因的编码产物都是啤酒酵母DNA复制需要的。前两者编码产物的功能还不清楚，RFC的基因编码产物是锁状输入器复合体的亚基之一。,裂殖酵母Cds1（SpCds1）和啤酒酵母中的同源物Rad53都是丝/苏氨酸激酶，可将某些参与检查点机制的蛋白特异磷酸化。 在体内有羟基脲的情况下，SpCds1和Rad53可被磷酸化和激活，这种激活需要SpRad53和和啤酒酵母Mec1（ScMec1）以及其它参与检查点机制的蛋白。 虽然遗传学和生物化学实验结果支持SpRad3/ScMec1在体内通过磷酸化作用直接激活SpCds1/ScRad53，但还有待于进一步确证。,为了更清楚地在分子水平了解S期检查点机制，需要寻找SpCds1/ScRad53激酶的关键底物。 近几年来人们已在这方面取得了较大的进展，在裂殖酵母中，检查点机制通过调节SpCdc2-cyclinB的磷酸化来阻止细胞的分裂。 SpWee1和SpMik1两种激酶将SpCdc2的15位酪氨酸磷酸化后，可恢复SpCdc2-cyclinB的活性。,Cds1可能可对这些Cdc2调节物的活性进行调节。 在体外，SpCds1确实可以将SpWee1和SpCdc25磷酸化。将SpCds1对SpCdc25的磷酸化位点突变后，可以引起S期检查点机制不能完全发挥作用。这提示在体内SpCdc25可能是SpCds1主要底物之一。 目前，SpCds1与SpCdc25相互作用的精确机制还不清楚。有研究表明，在体外，SpCds1对SpCdc25磷酸化后，可以直接抑制SpCdc25磷酸酶活性。也有研究表明，磷酸化的SpCdc25具有SpRad24的结合位点。在结合SpRad24后，SpCdc25可以被从细胞核中清除。 有趣的是，在裂殖酵母中，同一SpCdc25磷酸化位点也可以被蛋白激酶SpChk1磷酸化。在缺乏SpCds1的细胞中SpChk1可以被激活，并阻止细胞进入细胞分裂。在正常细胞中，SpChk1的激酶活性在检查点机制中起的作用很小。,SpCds1除了可以延长细胞周期的进行，在使细胞再从S期进行正常细胞分裂的过程中也是必需。 在正常细胞中，羟基脲的作用是可逆的，在去除羟基脲后，细胞可以恢复正常细胞分裂活动。羟基脲使缺失SpCds1和ScRad53的酵母细胞都失去生存能力。这可能和这些细胞不能完成DNA复制有关。 SpDfp1是Hsk1蛋白激酶的调节亚基。在HU处理的条件下，SpDfp1以SpCds1依赖的方式被磷酸化。而Hsk1-Dfp1是裂殖酵母DNA复制起始所必需的。,该实验结果表明，Hsk1在依赖Cds1的检查点机制中也发挥了一定作用。 在裂殖酵母中使细胞能够从S期阻断中有效恢复正常的另一个基因是rqh+,它编码一种与E.coli 的RecQ相似的解旋酶。 在DNA复制过程中，与DNA被UV射线损伤时，rqh1对细胞的存活起重要作用。目前，rqh+发挥作用的机制还不清楚。,2.S期DNA损伤激活的检查点机制 用放射线或DNA烷化剂对S期酵母细胞进行处理后，DNA复制变慢,这并不是由于DNA损伤影响复制叉移动那么简单。因为将参与检查点机制的基因突变后，DNA复制可以恢复正常。 因此，DNA损伤延长细胞周期S期是一个主动的过程，使细胞更好地耐受或修复DNA的损伤。,裂殖酵母S期DNA损伤激活的检查点机制关键步骤之一，也是SpCds1蛋白激酶的激活。 参与的基因包括rad1、rad3、rad9、rad17、rad26和hus1。 S期DNA损伤可以特异地激活SpCds1，发生在细胞周期其它检查点的DNA损伤，则激活SpChk1蛋白激酶。激活的SpCds1可以抑制SpChk1蛋白激酶。 在啤酒酵母，S期DNA损伤激活Rad53蛋白激酶依赖于POL2、DPB11、ORC1和RFC5基因。,S期DNA损伤激活的检查点机制可以通过抑制复制起始 或（和）复制延伸，使DNA复制变慢。DNA聚合酶/引物酶参与DNA复制延伸，并且可能参与S期DNA损伤所激活的检查机制。 已有报道，将啤酒酵母引物酶基因PR11突变后，发现酵母表现出对DNA损伤物质的高度敏感性，并不能延迟细胞S期的进行。那么引物酶是ScRad53的上游分子还是下游分子？ 将PR11突变后，发现并不影响从DNA损伤到ScRad53磷酸化的信号转导途径。这提示引物酶在ScRad53的下游发挥作用。,DNA引物酶被ScRad53途径修饰后，可使其在损伤DNA5端合成引物的能力降低，这是检查点机制可以引起复制暂停的可能之一。有许多证据可以证明S期DNA损伤所激活的检查点机制可使许多复制起点上的DNA复制起始。 用二维凝胶电泳对啤酒酵母的复制中间产物进行分析后，发现S期DNA损伤可以选择性抑制晚期复制起点的激活，且依赖于ScRad53。 有趣的是将正常细胞（不接触DNA损伤物质）的ScRad53突变后，发现一些晚期复制起始位点上的复制起始可以被提前。,这提示检查点机制可能与正常细胞周期中复制的起始有关。比如，由于核苷酸的消耗，早期复制起始位点上的复制起始可能激活检查点机制，并抑制晚期复制起始位点上DNA复制的起始。近来研究表明，检查点机制激活的ScRad53可以抑制Cdc45组装到晚期复制起始位点上。 Cdc7激酶也参与S期晚期复制起始复合物的激活，可能也是S期检查点机制的作用点。因为Cdc7在裂殖酵母中的同源物Hsk1及其调节亚基Dfp1在体内的磷酸化是依赖SpCds1。 在体外，纯化的SpCds1可以直接磷酸化Dfp1。遗传学实验和双杂交试验也表明，在啤酒酵母中可以相互作用。,3.哺乳动物细胞中的检查点机制 哺乳动物细胞与酵母一样，在DNA损伤时，可以激活检查点机制，并抑制DNA的复制。在人体内，已发现了许多酵母检查点蛋白的结构同源物。 这提示检查点途径是比较保守的。 哺乳动物细胞有几种PI3k样蛋白激酶与SpRad3/ScMec1同源，比如ATM、ATR、DNA-PK等。,2007年8月生物化学杂志报道科学家发现干细胞蛋白质调控新机制。干细胞中的Oct4蛋白质起着调控作用，决定干细胞是继续分化成其他特殊细胞，还是保持干细胞的多功能性。通过化学途径可以改变Oct4蛋白质，从而决定干细胞的命运。德国和美国科学家共同发现了一个Oct4蛋白新的调控机制，一种特殊的蛋白质可以和干细胞标记结合，从而延长蛋白质的生命和增强读取基因信息的功能。 他们认为干细胞的多功能程度是有限的，它既可以发展成不同组织的细胞，也可以发展成肿瘤细胞，其发展方向在很大程度上受Oct4蛋白质影响。在研究中发现，Oct4能与基因中的转录因子结合，通过这种方式使干细胞保持其多能性，并使干细胞仅向一个方向发展。科学家称，Oct4可有不同的作用机制，在和转录因子结合期间，一些小分子的结合会导致蛋白质的化学变化。研究表明，所谓的SUMO蛋白质和转录因子有很强的结合倾向，并以此改变其功能。,他们的实验显示，SUMO-1(4种SUMO蛋白的一种)可结合到Oct4蛋白上，从而延长了Oct4的生命。他们把SUMO1和Oct4蛋白注入活性干细胞中，用显微镜观察荧光抗体来检测，发现这两种蛋白质分子互相结合在一起。研究人员分析了SUMO-1蛋白质结合点的位置，有目的地使Oct4可能的结合点失效，人为地使118号赖氨酸作为结合点。由于这个点在DNA结合点附近，结果发现，SUMO-1和Oct4的结合体能更加有效地结合到DNA上。 研究人员还发现，Oct4和SUMO-1蛋白质的结合体可以更好地操纵转录启动因子，SUMO-1不仅改善Oct4蛋白质功能，并且延长Oct4的寿命。在两种蛋白质注入活细胞16小时后，结合蛋白质形态比未结合形态多4倍。换言之，通过结合到Oct4上，SUMO-1调控干细胞内Oct4的含量，并由此决定干细胞是向正常方向还是向肿瘤方向分化，这个发现很可能对肿瘤治疗有所帮助，特别是对于高Oct4蛋白质浓度造成的肿瘤。,第三节 基因突变和DNA损伤修复 遗传和变异都是生物界普遍存在的自然现象。遗传和变异的基础都是DNA的碱基排列序列, 遗传是DNA的碱基排列顺序忠实地传给下一代, 变异是DNA的碱基序列发生改变,且可以遗传。 DNA损伤是某些因素作用下, DNA的结构和功能发生改变, 阻碍DNA的复制与转录, DNA的这种变化称DN