代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制

项目名称首席科学家起止年限依托部门代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制赵世民 复旦大学2012.1 至 2016.8教育部 上海市科委一、关键科学问题及研究内容关键科学问题本课题将以代谢相关的蛋白质翻译后修饰为切入点，系统挖掘参与代谢酶修饰调 控的乙酰化和磷酸化等修饰酶及其修饰底物，系统挖掘被代谢物调控的下游被甲 基化和羟基化等修饰的蛋白；在此基础上研究其对细胞代谢的作用，作用的分子 机理以及在肿瘤发生中的变化规律和生理病理意义；并通过结构生物学方法寻找 通过干预修饰进而干预代谢的小分子化合物。具体地，将就如下关键科学问题开 展研究：1. 发展相关技术和研究体系，系统地挖掘代谢相关翻译后修饰的修饰酶及其底 物；探索相关蛋白质修饰酶类和底物通过何种网络及分子机制进行调控。2. 在肿瘤发生、发展过程中，代谢相关翻译后修饰如何变化，以及这些变化对 于肿瘤发生发展有何病理意义。3. 研究能否通过活性小分子化合物干预代谢相关翻译后修饰，进而干预代谢来 实现肿瘤的预防与干预。主要研究内容我们将以项目组成员前期在代谢相关的蛋白质翻译后修饰研究为基础，从广度与 深度上扩展对代谢失调引发肿瘤机理的研究。在广度方面主要系统地发现参与细 胞代谢调控的翻译后修饰的修饰酶，以及被代谢物调控的下游底物蛋白和信号通 路。在深度方面主要研究各种翻译后修饰调节代谢的分子机理，重点研究乙酰化 修饰参与代谢调控的机制；在代谢物调控下游翻译后修饰和信号通路的分子机理方面，我们将重点研究对组蛋白甲基化和DNA去甲基化酶的调控机理；同时， 用结构生物学的策略寻找针对上述具有治疗潜力的靶分子的活性小分子化合物。1. 代谢相关的蛋白质的修饰谱及其在肿瘤发生发展过程中的变化规 律 以肝癌和神经胶质瘤等癌症为模型，建立全细胞的与代谢相关的蛋白质乙酰 化、磷酸化、羟基化、甲基化修饰鉴定的技术方法与平台。探讨这些肿瘤发病过 程中代谢酶的乙酰化、磷酸化修饰的动态变化，以及被代谢中间物调控的下游羟 基化、甲基化等蛋白底物与动态变化。2. 肿瘤发生发展过程中代谢组的变化规律及其与代谢相关修饰变化 的对应关系与调控机制 通过代谢组学、遗传学以及生物化学策略，比较肿 瘤细胞与正常细胞中的代谢物组成特点，重点探讨代谢相关修饰改变与代谢组改 变的内在联系；建立能反应肿瘤特征的代谢组谱，力争发现肿瘤特异性代谢标志 物（群）。3. 肿瘤发生发展过程中一些代谢产物作用的信号通路及对肿瘤发生 发展的意义 系统地研究与肿瘤发生密切相关的糖酵解通路与三羧酸循环通路相关代谢中产 物在肿瘤发生发展过程中的作用机理。重点研究酮戊二酸（KG）及其结构 类似的等代谢中间物影响各种 KG依赖的系列双加氧酶功能的分子生化机理及 其对细胞信号通路的影响，包括 KG对PHD、系列组蛋白去甲基化酶以及DNA 去甲基化酶活力的影响以及相关双加氧酶活力被抑制激活后细胞的生理变化， 特别是细胞在表观遗传性状及血管新生等生理性状受双加氧酶活力改变的影响。4. 筛选针对蛋白质修饰酶的活性小分子化合物及其作用机制 针对组学和机理研究所发现的具有重要价值的蛋白质修饰酶类（包括乙酰化酶、 去乙酰化酶、双加氧酶、羟基化酶及甲基化酶等）, 采用基于结构生物学原理的 小分子干预物质的计算、模拟，从天然产物筛选或者人工直接合成出能干预蛋白 质修饰酶类活性的小分子化合物, 通过对发现的活性小分子化合物进行生化、生 理功能进行验证，然后根据结晶学手段解析蛋白修饰酶与小分子化合物形成复合 体的三维晶体结构，根据小分子化合物与蛋白修饰酶结合的关键结构元素特点， 对可能成药的小分子进行优化及药理效应研究。二、预期目标总体目标从代谢相关蛋白质修饰的发生、调节和动态相互作用机制及其生理病理意义这一 核心科学问题出发,构建高通量蛋白组学方法、系统地挖掘与代谢密切相关的蛋 白质乙酰、磷酸化、羟基化及甲基化修饰酶类及其靶蛋白的蛋白质组学、系统生 物学和生物信息学内涵；用遗传和生物化学方法鉴定一批新的蛋白质乙酰化修饰 酶类, 用代谢组学方法比较乙酰化修饰酶类在生理及病理条件下蛋白组水平的 变化及因此引起的代谢酶乙酰化修饰变化和细胞代谢组变化；建立全细胞水平的 蛋白质羟基化修饰靶蛋白数据库 并确定一些关键羟基化蛋白质的动态调控机制, 并研究它们的信号调控网络；以机理研究为根据，通过结构生物学方法系统研究 蛋白修饰酶HAT、SIRT和双加氧酶的结构，以及修饰酶与代谢中间物和修饰酶 底物组成的复合体的分子结构，利用结构信息，结合生物化学，生物物理学及细 胞生物学的方法，通过改变相关蛋白质以及它的整个复合体在此的作用位点的结 构来验证其生物学功能，为治疗修饰酶相关疾病提供小分子药物设计和优化的结 构模板，为修饰酶相关的癌症等疾病的治疗提供新的途径, 确定并优化可以调节 代谢酶乙酰化活性的小分子药物先导化合物。 通过本课题的实施使我国在代谢 与肿瘤发生研究的相关领域保持来之不易的国际领先地位；力争使我国在该方向 的转化医学研究和开发具有自主知识产权的抗癌新药重大需求方面有所突破。最 后,以本项目的实施为契机, 促进国内蛋白质组学、代谢组学、生物化与分子生物 学、 结构生物学以及生物信息学的衔接和交叉集成, 使参与课题的年轻骨干成员成为国内相关研究的领军人才，使参与单位成为国内开展代谢与肿瘤研究的基地，同时培养一批交叉学科人才。五年目标1. 初步建立乙酰化调控代谢酶的网络系统系统鉴定参与各个代谢酶乙酰化的修饰酶，主要研究糖酵解通路和三羧酸循环通 路中各个代谢酶的乙酰化修饰酶。阐明乙酰化酶和去乙酰化酶对于各个代谢酶生 化性质的调控机理。阐明乙酰化酶和去乙酰化酶对于各个代谢中间物的调控后 果。明确乙酰化修饰与已知磷酸化等修饰之间对代谢调控的相互关系。2. 明确翻译后修饰对代谢物的调控系统系统研究代谢酶翻译后修饰改变对细胞代谢物的调控作用。用代谢组学方法研究 单个及多个代谢酶翻译后修饰改变对细胞代谢物及代谢流(metabolic flux )的影 响，重点研究如何通过调节代谢酶的乙酰化水平调节糖酵解通路与三羧酸循环通 路的相对代谢流。寻找抑制Warburg effect进而抑制肿瘤生长的方法。3. 建立代谢物影响表观遗传及信号通路的调控网络明确细胞内KG及其结构类似代谢物浓度对于组蛋白甲基化水平和DNA甲基 化水平的调控机理。重点明确包括延胡索酸（fumarate）、琥珀酸（Succinate）、 苹果酸（malate）以及2 hydroxylglutarate等 KG结构类似代谢物对于组蛋白甲 基化水平和DNA甲基化水平的调控机理。阐明5 10个因组蛋白甲基化水平或 DNA甲基化水平改变导致的下游基因表达改变及其病理生理效应。系统寻找细 胞内活性受KG及其结构类似代谢物浓度调控的脯铁酸軽基化酶。建立蛋白质 羟基化的蛋白组学分析方法，用蛋白修饰组学方法鉴定全细胞水平羟基化修饰的 蛋白质底物。阐明5 10个軽基化修饰的底物蛋白在 酮戊二酸及其结构类似代 谢物浓度改变时导致的信号通路改变及生理病理效应。4. 解析35个代谢相关蛋白修饰调控酶的晶体结构，设计并优化 510个可以调节代谢或抑制代谢相关肿瘤发生信号通路的药物先导 小分子化合物根据乙酰化修饰调控酶对于调控代谢酶活力及代谢中间物的重要性以及根据双 加氧酶对于调控下游基因的重要性，有选择性的解析35个代谢酶相关的乙酰化 修饰酶的晶体结构。基于具有生理或临床意义的候选的修饰酶,结合修饰酶的结 构特点，发现或合成能干预其活性的小分子化合物，就其药理效应开展在细胞甚 至整体水平的深入研究并优化其结构与功效。争取对每一种候选的修饰酶发现 3 种以上的先导小分子化合物。5. 取得具有国际影响的原创性成果并力争实现转化突破 在国际重要学术刊物上发表高水平论文 50 篇以上。其中,在影响因子大于 10 的 刊物发表 10 篇以上，在代谢与肿瘤研究取得国际领先地位。申请815项与本 项目成果直接相关的发明专利，并有12项实现初步转化。6. 培养一批国内从事代谢调控及蛋白质修饰研究的交叉学科人 才，使其中部分人才具有一定国际知名度。三、研究方案 本项目将以已知的与代谢密切相关的肝癌、胃肠肿瘤以及神经胶质瘤 等癌症为模型，开展研究。学术思路围绕代谢相关蛋白质翻译后修饰调控肿瘤发生这个核心主题，我们将聚焦代谢调 控机制与代谢物和代谢下游信号通路这三个关键因素，解析如下主要科学问题： 1，肿瘤细胞中与代谢相关的蛋白质翻译后修饰的作用与调控机制；2，肿瘤过 程中与蛋白质修饰调控相关的代谢中间物产生的特点与机制； 3，肿瘤过程中与 蛋白质修饰调控相关的代谢中间物对肿瘤相关信号通路的影响。并在此基础上， 明确与代谢调控的及与代谢中间物相关的下游蛋白质靶标，进而通过结构生物学 的方法寻找可以调控这些靶标蛋白的药物先导化合物。技术途径一、采用方法学研究与应用研究并重的研究策略，研究代谢相关的蛋 白质翻译后修饰。 针对课题组成员已经发展了蛋白质磷酸化、甲基化、乙酰 化等检测技术，以及对于蛋白质组羟基化修饰的分析还缺乏成熟手段的现状，在 本课题中我们采用方法学研究与应用研究并重的研究策略。具体技术途径包括： 1. 利用固相标记定量技术进行蛋白组学分析。溶液标记是广泛使用的标准标记方法，该策略需要许多人为操作步骤，如样品除 盐，添加标记试剂，孵化反应，终止反应，样品混合，除盐等，这些都会影响样 品的回收率和分析的重复性，而且费时费力，容易出错。我们将使用我们发展的 基于两相柱的固相标记定量多维分析的平台开展相关蛋白组学研究。平台将固相 标记与多维分析结合，有利于定量的自动化实现蛋白质组的通量化分析，可以在 30个小时(包括标记时间)定量分析1000多个蛋白质。 2. 利用抗体亲和富集技 术开展蛋白质组乙酰化组分析。 蛋白质组乙酰化分析的关键是如何有效富集乙 酰化肽段。我们制备的抗体可以高特异性的将乙酰化肽段富集出来。蛋白质组样 品经过分级后，每个组分分别用蛋白质酶切。然后利用抗体将赖氨酸残基乙酰化 的肽段富集出来，接着利用液相色谱质谱连用分析富集的肽段，最后利用数据库 检索和数据处理实现乙酰化蛋白质与其修饰位点的鉴定。利用该方法分析蛋白质 组乙酰化，可以鉴定上千个赖氨酸乙酰化蛋白质。 3. 采用固定亲和技术进行蛋 白质组磷酸化分析。 蛋白质组磷酸化的分析需要包括磷酸化肽段提取技术、磷 酸肽的鉴定技术等多种技术的整合。我们发展了一种具有自主知识产权的基于钛 离子的固定亲和色谱(Ti(IV)-IMAC)的磷酸肽富集技术，比常规富集技术能鉴 定更多的磷酸肽；在磷酸肽鉴定的数据处理方面，发展了一种结合二级和三谱高 可信鉴定磷酸肽的方法，开发了一个磷酸化蛋白质组分析专用的软件。为了能够 规模化分析，还需要对复杂组学样品进行有效分级。我们因此发展了一种具有高 正交性质的反相色谱(RPRP-LC)技术用于磷酸肽的多维分离。将Ti(IV)-IMAC富集 技术、RPRP-LC多维分离技术和磷酸肽鉴定的数据处理技术与平台结合起来，可 以组成一个具有鉴定上万个磷酸化位点的蛋白质组磷酸化规模化分析的平台。4 完善并采用重甲基SILAC技术进行蛋白质组的甲基化分析。蛋白质甲基化主要修饰精氨酸、赖氨酸残基，但也修饰谷氨酸、组氨酸、天冬氨 酸等其它残基。由于在多个残基上都可以被修饰、有的残基如赖氨酸还能被多达 三个甲基修饰，所以在蛋白质组学分析中鉴定甲基化肽段，需要在数据库检索中 设臵很多可变修饰，这使检索空间急剧扩大，导致甲基化修饰的肽段很难被可信 的鉴定出来。在Mann等人发展了一种重甲基SILAC技术中，细胞代谢使13CD3 蛋氨酸转化为细胞唯一的甲基供体13CD3SAM（S-腺苷甲硫氨酸），从而使标记的 样品中的所有甲基化肽段与没有标记的样品中的甲基化肽段有了一定的质量差 别。当标记的样品与不标记的样品混合时，在质谱中成对出现的峰就是甲基化的 肽段，从而将其与大量的非修饰肽区分出来。Mann等人利用这种技术鉴定了 59 个精氨酸甲基化位点。最近我们改进了这一方法，直接利用合成的13CD3SAM 进行代谢标记，可以使鉴定的甲基化蛋白质超过100个。二、采用遗传与代谢组的方法系统研究与代谢相关的蛋白质的修饰的 调控网络及其对代谢组的作用。1. 采用自上而下式的思路研究蛋白乙酰化 过程失调对相关蛋白功能、代谢调控通路、代谢产物及整体生化网络的系统影响。 利用建立的代谢组测定方法（GC-Tof/MS, NMR）,测定正常及肿瘤细胞胞质 中的代谢物组成，研究肿瘤细胞代谢特征及寻找肿瘤相关特异代谢物谱；正常及 肿瘤细胞中比较过表达去乙酰化酶基因、去乙酰化酶抑制剂SAHA干预条件下的 特征性代谢通路/网络变化；比较肿瘤细胞及正常细胞对乙酰化调控的反应；研 究蛋白乙酰化异常导致代谢变化与肿瘤细胞生长间的关联；通过对不同剂量 SAHA干预条件下细胞代谢谱动态分析，描述蛋白乙酰化对代谢过程影响的动态 特征；在分子水平发现能刻画肿瘤特征的代谢模式、特征（修饰）蛋白表达谱以 及代谢标志物（群），初步阐述若干个关键环节的分子机制以及调控网络（研究 流程见附图2）。 2. 通过构建过表达去乙酰化酶基因的正常及肿瘤细胞模型， 并结合施以去乙酰化酶抑制剂处理；采用LC/LC-MS/MS和双向电泳蛋白质组技 术系统分析胞质蛋白质及乙酰化蛋白质表达情况，同时用国际上两大代谢组学流 派所采用的核磁共振技术和色质联用技术分析胞质代谢物谱；创新性地建立 “Printing Assay ”分析方法，对同一状态下生命体的蛋白质组、乙酰化蛋白质组及 代谢组数据，利用计算生物学方法进行计算整合，结合KEGG等代谢途径的网络 数据库，筛选与肿瘤发生发展密切相关的关键蛋白质和代谢调控网络，一体化地 分析蛋白乙酰化修饰对细胞代谢的调控作用；发现与揭示肿瘤发病过程中小分子 代谢物与蛋白质间的相互关系，阐明过度激活或抑制的代谢途径在代谢网络异常 改变中的作用及其生物学效应，为代谢分子功能异常导致蛋白修饰、调控失常的 疾病研究提供新思路；在对干预肿瘤细胞蛋白乙酰化过程的代谢组与蛋白质组分 析的基础上，构建关键代谢物失调的细胞模型，利用分子生物学方法研究肿瘤相 关异常代谢途径中所涉及的蛋白质水平或活性的改变；在基于对肿瘤异常代谢途 径认识的基础上，寻找各种生理、病理状态下的关键调控通路和网络变化以及引 起这些变化的分子作用机制；通过对细胞模型的药物干预，发现和验证功能蛋白 质分子，以及发现潜在的疾病治疗靶点。作为代谢组学和蛋白质组学的一个重要技术组成-计算生物学数据分析和整合中 扮演着举足轻重的角色，尤其是基于不同水平（蛋白质组-乙酰化蛋白质组-代谢 组）、不同处理（对照-去乙酰化-乙酰化）的数据整合。因此，本方向还将同时 采用比较研究策略分析正常及肿瘤细胞的乙酰化蛋白表达特征和代谢物谱及代 谢通路特征；通过综合使用各类高通量信息提取和多元化分析技术，分析生化网 络在常态和病态下的结构组成和动态变化。如何建立和完善适用的计算生物学方 法，从海量的生物化学数据中提取有用的与肿瘤相关的信息并在蛋白质与代谢物 水平进行整合是本部分重要研究内容之一。 3. 蛋白质乙酰化修饰的上游调控酶 SIRT及乙酰化酶功能及调控的上下游机制及其在代谢物调控中的作用及生理意 义。主要研究：（1）在肝癌HepG2细胞中，研究SIRT1和p300调控的乙酰化修饰 水平是否影响肝癌细胞脂肪酸合成和细胞增殖，以及ChREBP的表达和转录活性 是否在其中发挥重要作用；（2）比较ChREBP敲除鼠（已有）和野生型小鼠在化 学致癌剂（二乙基亚硝胺，DEN）和高脂饮食条件下肝癌发生的异同，并进一 步研究肝脏不同乙酰化水平对于以上小鼠模型中肝癌发生的影响；（3）比较100 例左右肝癌病人的肝癌组织及其正常肝组织的Sirtl，p300和ChREBP的mRNA和 蛋白水平以及ChREBP的乙酰化水平，寻找其中变化规律及其与肝癌细胞增殖和 病人各项生理指标的关系。三、利用分子细胞生物学、生物化学方法，我们将主要研究代谢酶的 乙酰化与磷酸化等翻译后修饰调控代谢的分子机制，以及代谢中间物 通过影响下游蛋白质翻译后修饰调节细胞信号通路的分子机制。1. 通过培养的细胞系研究乙酰化、磷酸化等翻译后修饰对代谢酶的调节作 用。选用代谢相关组织的细胞系HEK293 （肾细胞）、HepG2 （肝细胞）和U87MG（神经胶质瘤细胞）等作为实验材料开展培养细胞的各项试验；采用第一、第二 类去乙酰化酶（HDACs）抑制剂TSA （5 g/ml）与第三类去乙酰化酶（SirTs） 抑制剂Nicotinamide （5 10mM）同时处理细胞或病理样品以获得不同乙酰化水 平的蛋白质，研究乙酰化对代谢酶生化性质的影响；用NaF或Vanadate抑制磷酸 酶活力，研究磷酸化对蛋白功能的调控；采用western blotting方法检测蛋白质的 乙酰化、磷酸化、甲基化或羟基化，采用自制或商业购买的抗乙酰化赖氨酸探测， 用GE公司的ECL plus显色，GE公司的Typhoon Trio扫描仪检测；采用siRNA或 shRNA方法对需要敲落的相关基因进行敲落，采用knock in，overexpress等方法在 细胞中表达需要的基因。采用Tandem Affinity Purification （TAP ）及免疫共沉淀 技术鉴定及确认参与代谢酶乙酰化的修饰酶；各个代谢酶、代谢酶修饰酶（乙酰 化酶及去乙酰化酶）以及各种双加氧酶（PHD、组蛋白去甲基化酶、DNA去甲 基化酶）的酶活的测定将按照文献方法进行。2. 通过培养的细胞系研究代谢物对细胞表观遗传及下游信号通路的调控。通 过外源添加细胞膜可渗透的代谢物衍生物，如酯化的 酮戊二酸、延胡索酸、琥 珀酸等，改变细胞内的特定代谢物的浓度，检测组蛋白甲基化水平、DNA甲基 化水平以及包括HIF家族在内的蛋白羟基化水平，同时研究因这些改变导致的下 游效应，生化检测方法同上；在改变细胞代谢物浓度的条件下运用microarray、 Chip seq等手段研究因代谢中间物改变引起的组蛋白或DNA甲基化变化调控的 下游基因表达变化以及蛋白与细胞核内不同功能DNA区段的互作情况，并运用 生物信息学方法进行分析和数据整理。3. 建立动物模型研究翻译后修饰对于代谢的调控，以及修饰失调的病理效 应。在小鼠模型中敲除/敲入特定的一个或数个修饰酶/代谢酶，研究这些改变对 于小鼠代谢组、信号通路的影响。重点研究可加强/抑制Warburg effect的乙酰化 调控动物模型的肿瘤发生率的改变；研究通过改变乙酰化修饰酶调节细胞酮戊 二酸、延胡索酸、琥珀酸的动物模型，研究这些改变对于肿瘤发生的促进/抑制 作用4. 选用人肝癌、胃肠道癌、神经胶质瘤等肿瘤标本确认乙酰化蛋白质翻译后 修饰、细胞表观遗传性状以及相关信号通路在肿瘤发生过程中发现了改变。用免 疫组化方法研究蛋白质、蛋白质乙酰化、蛋白质甲基化、DNA甲基化以及蛋白 质羟基化的改变；用deep sequence研究修饰酶或其他基因的突变；通过检测样品 中蛋白质的磷酸化水平等方法研究是否有信号通路改变。四、用结构生物学方法研究蛋白质修饰酶功能活性及特异性调控 的结构基础。 1. 研究双加氧酶的催化机制，以及各种小分子，如系统研究代 谢中间物a-KG等，是如何影响各种修饰酶对底物的识别和催化活性的调控我们 将重点解析以双加氧酶相关蛋白复合体的结构与功能。我们将采用共结晶的方式 获取代谢中间物（如a-KG、2HG）与双加氧酶（CeKDm7A JmjC结构域）和组 蛋白底物（如H3K9me2、 H3K79me2等）相互作用的蛋白质复合体晶体的并解 析其结构。我们还将研究这些小分子代谢中间物与其它双加氧酶如hJDM1A等形 成复合体的晶体结构，通过比对这些不同双加氧酶复合体的结构特点，研究不同 家族中双加氧酶的底物特异性识别机制。 我们将深入探索寻找调控蛋白修饰功 能（如小分子肿瘤抑制化合物）的分子途径，继续双加氧酶与代谢中间物（如a -KG和2HG）不同类型衍生物的结构与功能的研究，并将各种衍生物小分子对双 加氧酶结构域的识别进行详细对比研究。我们将通过对结构与功能之间存在的密 切关系的研究来阐述各种衍生物小分子是如何识别并控制双加氧酶其结合的强 度和特异性，且如何诱导相应的构象变化来决定双加氧酶的激活状态。这些都是 酶特异性抑制剂设计的核心问题，解决了这些问题，将会使我们能为不同信号通 路引起的疾病提供针对性的治疗靶子。 2. 研究蛋白质修饰酶全酶或多个结构域的活性调节的分子机制 这些修饰酶中许多都含有能对特定修饰基团进行结合和催化修饰等不同功能的 结构域。目前为止，这些染色质修饰酶的结构研究大部分都是对单独功能结构域 的研究，尤其是蛋白催化核心结构域。但是，多个结构域是如何相互作用来协调 完成蛋白修饰的？各种修饰酶在不同复合体中的空间排布及结构调控机制存在 什么样的机制和差异？与相对保守的催化活性结构域不同的是，修饰酶的其他区 域具有较大的非保守性和多样性。不同调控小分子，女口a-KG等，是如何影响各种 修饰酶多个结构域的空间排布及构象变化来对底物的识别和催化活性进行调控 的？不同的多个结构域的空间排布及构象变化对最终调控的病理生理反应具有 什么功能？这些问题，都需要我们提供清楚详细的多结构域的完整三维晶体结构 以及结构与功能的构效关系的研究数据来解释。因此，解决多结构域的完整结构 将是修饰酶结构生物学研究领域的重点。LSD1/IKDM1的结构研究，展示了含有 三个不同结构域的蛋白的空间结构：N端SWIRM结构域、中间的Tower结构域和 C端的类似氨基酸氧化酶的结构域AOL(amine oxidase-like)。除了JmjC结构域，大 部分含JmjC结构域的组蛋白赖氨酸去甲基酶都含有PHD指状结构域，表明它们可 能与蛋白-DNA的结合有关。我们将继续对代谢中间物(如a-IKG和2HG)与含有 多个结构域的各种双加氧酶形成复合体的结构与功能的研究。这些结构，将会清 晰揭示代谢中间物是如何组织双加氧酶空间结构并如何与底物结合，更重要的 是，这些结构将会清楚解释，代谢中间物是如何将调控信号传递到修饰酶的特异 DNA靶点，调控特异基因的表达，系统的阐明相关信号转导通路的结构功能机 理。 3. 蛋白修饰酶与核受体转录因子相互调控的结构及调控机制 蛋白修饰酶 的活性与特异性受各种蛋白及小分子的多重调节， 从而参与对不同靶基因表达 的调控。核受体(nuclear receptor,NR)是一类在生物体内广泛分布的配体依赖的转 录因子，在代谢、发育、癌症等方面起着重要调节作用HDAC和HAT的许多成 员发挥功能的途径之一都是通过与核受体形成蛋白复合体来实现的。如HAT家族 的p300、CBP、SRC1 和SRC3等，HDAC家族的SIRT1等，在体内都能与核受体形 成蛋白复合体，相互调控并调节系列生物学功能。人们对SIRT家族的蛋白晶体结构已经有了一定的研究，主要集中在SIRT的保守 催化活性结构域的结构报道，包括SIRT活性结构域、以及该结构域与底物如含p53 等去乙酰化位点的多肽和/或NAD+、Suramin等形成复合体的晶体结构。仅有一 例报道酵母SIRT2同源蛋白Hst2的全长蛋白的结构，该结构表明了 N端和C端非保 守区域对Hst2催化活性域的奇特空间结构以及其重要调节作用。这些有限的数据还远远不够我们清楚认识SIRT去乙酰化的作用调控机理。本 课题拟系统研究人源SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT5和SIRT7这些有去乙酰化活性 的SIRT家族成员的蛋白晶体结构，包括：SIRT催化结构域与核受体如PPARy、 FXR、SHP、PPARa等结合区域形 成复合体的晶体结构；SIRT全长蛋白与核受 体如PPARy、FXR、SHP、PPARa等全长蛋白以及其靶DNA形成复合体的晶体结 构；研究核受体如PPARy、FXR、SHP、PPARa等的配体(胞内代谢产物如脂肪 酸、胆汁酸等)通过核受体对SIRT活性影响的结构机制；研究SIRT配体对在SIRT 与核受体形成复合体的基础上调节SIRT活性的结构机制；研究各种小分子化合物 通过SIRT/NR在肿瘤信号通路中的调控机理。4.设计并优化可以调节代谢或抑 制代谢相关肿瘤发生信号通路的药物先导小分子化合物。 根据上述对干预修饰 酶活性的小分子化合物的生化、生理、病理研究，结合小分子化合物与修饰酶结 合的结构特点，通过改变修饰酶与小分子结合的关键结构元素，结合生物化学、 分子生物学与细胞生物学等手段，验证其生物学功能，为治疗修饰酶相关疾病提 供小分子药物设计和优化的结构模板。最后通过动物体内生理功能研究，确定先 导小分子药物。创新点与特色、取得重大突破的可行性1. 本项目瞄准国际肿瘤研究中代谢失调与肿瘤发生这个最前沿领域，以转化医 学研究为侧重点，力图实现基础与应用研究的有机结合。2. 项目前期研究基础已经具有国际前沿水平，在激烈的国际竞争中我们具有自 己独特的优势。其中，复旦大学研究团队在代谢酶乙酰化修饰和代谢物调控肿瘤 相关细胞信号通路等领域取得的成果得到国际高度评价。项目组成员在蛋白组方 面创新了多种方法蛋白质组的定量分析、磷酸化分析和乙酰化分析等方面，尤其 在定量蛋白质组学分析方面发展了独特的技术平台。如固相标记定量技术可以在 30个小时内自动标记定量1000个以上蛋白质，拥有自主知识产权的新技术建立 的磷酸化分析平台也可以实现从一个复杂蛋白质样品中鉴定上万个磷酸化位点， 利用重甲基SILAC技术鉴定59个精氨酸甲基化位点，高特异性的抗体可以实现鉴 定1000个以上赖氨酸乙酰化蛋白质的能力等。上海交大在上一个973项目中已经 积累了丰富的代谢组学研究的经验；李勇等人解析了众多药靶蛋白的晶体结构 等。 3. 本项目聚集了国内近年来在该领域取得国际水平成果的研究团队，以及 一批近年来从包括Craig Thompson及Da ng C.V.实等国际代谢与肿瘤领域顶级 实验室全职回国的精干年轻研究人员，知识结构和研究理念处于国际前沿。此外， 课题组成员知识结构覆盖生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生 物信息学、和结构生物学等领域，依托国家和部门重点实验室、教育部985 创 新平台等良好硬件支撑。各课题间研究相互交叉、组成了一个有机的整体。课题 负责人和主要骨干成员均有在国内外长期从事科研的经历，近年发表数量众多高 水平论文，显示了极强的创新能力。 4. 利用中国独特的团队作战组织方式，系 统的对代谢相关的蛋白质翻译后修饰在肿瘤发生过程中的变化与作用机理进行 研究，这样将有利于产生高水平的研究成果。5. 项目推荐首席科学家赵世民教授具有多年跨国生物医药企业研发经验，回国 后5年内主持自然科学基金重点项目，参与973和863等多个项目。尤其在完成国 家863项目蛋白质翻译后修饰的蛋白组学研究(2006AA02A308)的过程 中，与多位合作者合作取得4年发表SCI论文16篇、其中影响因子大于20的5篇， 近两年论文他引238次的突出成绩，成果为国际广泛关注。其项目组织协调能力 以及转化医学研究实力都得到充分验证。课题设置课题1 ： 代谢相关的蛋白质的修饰谱及其在肿瘤发生发展过程中的变化规律 预期目标：利用修饰/比较蛋白组学方法研究代谢相关翻译后修饰的底物,以及这 些修饰在肿瘤发生过程中的变化规律。主要研究内容： 1. 建立全细胞蛋白质修饰鉴定的技术方法与平台，并应用这一 平台进行如下研 究： 2. 系统地研究肿瘤发生过程中代谢酶乙酰化磷酸化修饰 的变化规律； 3. 系统鉴定受代谢中间物调控的下游蛋白修饰(羟基化、甲基化 等）底物蛋白谱及网络； 4. 系统地研究肿瘤发生过程中受代谢中间物调控的下 游蛋白修饰的变化规律。经费比例： 23%承担单位： 中国科学院大连化学物理研究所、复旦大学课题负责人： 叶明亮学术骨干：管坤良、Daniel Figeys、张宇、苏志熙课题2 ： 代谢相关的蛋白质的修饰的调控网络及其对代谢的作用预期目标： 采用遗传与代谢组学方法研究代谢相关蛋白修饰失调对相关蛋白功 能、代谢调控通路、代谢产物及整体生化网络的系统影响；同时通过综合使用各 类高通量信息提取和多元化分析技术，分析生化网络在常态和病态下的结构组成 和动态变化。主要研究内容： 1 系统鉴定参与代谢过程中特定蛋白质修饰的上游调控酶（如乙酰化中的HAT与Sirt等），研究其功能及调控的上下游机制；2.用代谢组的 方法系统研究各修饰调控酶对于代谢组的影响； 3 研究肿瘤发生过程中代谢 相关蛋白修饰上游调控酶及对应代谢组的变化规律。经费比例： 23%承担单位： 上海交通大学课题负责人： 万春玲学术骨干： 童雪梅、糜军、王晓艳、左勇课题3 ： 代谢相关蛋白质修饰的分子调控机理及其在肿瘤发生中的作用与机制 预期目标： 在培养细胞系中初步建立乙酰化等翻译后修饰调控代谢的信号网络； 建立代谢物调控细胞表观遗传及下游蛋白的信号网络；建立乙酰化等翻译后修饰 调控肿瘤发生的动物模型；通过临床研究认代谢相关翻译后修饰在肿瘤发生过程 中的变化规律。主要研究内容： 1. 研究蛋白质修饰（乙酰化、磷酸化）对代谢酶功能调控的分子机制；2.系统研究代谢中间物（如KG等）影响各种修饰酶（脯氨酸羟 基化酶、组蛋白去甲基化酶及DNA去甲基化酶等双加氧酶等）功能的分子生化 机理及其导致的下游信号通路改变，建立代谢相关的蛋白质翻译后修饰调控网 络； 3 研究蛋白质修饰在肿瘤代谢中的作用与机制，以一或几种肿瘤为对象 研究在其发生发展过程中代谢的改变与蛋白质修饰的关系，蛋白质修饰及调控机 制对肿瘤发生发展的影响等。经费比例： 31%承担单位： 复旦大学、济南军区总医院课题负责人： 赵世民学术骨干： 徐人尔、乔彬、段文元、方彩云课题4 ： 代谢相关蛋白修饰上游修饰酶的结构，寻找调控蛋白修饰的小分子肿 瘤抑制化合物的研究预期目标：系统研究蛋白修饰酶HAT、SIRT和双加氧酶的结构，以及修饰酶与 代谢中间物和修饰酶底物组成的复合体的分子结构，利用结构信息，结合生物化 学，生物物理学及细胞生物学的方法，通过改变相关蛋白质以及它的整个复合体 在此的作用位点的结构来验证其生物学功能，为治疗修饰酶相关疾病提供小分子 药物设计和优化的结构模板，为修饰酶相关的癌症等疾病的治疗提供新的途径。 主要研究内容： 1 研究蛋白质修饰酶功能活性及特异性调控的结构基础。2 研究蛋白质修饰酶全酶或多个结构域的活性调节的分子机制。 3 研究蛋 白修饰酶与核受体转录因子相互调控的结构及调控机制。 4 验证小分子与相 关酶的构效关系，提供先导小分子化合物的优化设计模板。经费比例： 23%承担单位： 厦门大学、复旦大学、中国科学技术大学课题负责人： 李勇学术骨干： 张华凤、刘懿、金利华课题间关系 根据总体设计方案，本项目将以代谢相关的蛋白质乙酰化、甲基化、磷酸化、羟 基化等修饰为核心，以乙酰化、磷酸化对代谢酶和代谢组的调控，代谢物对下游 蛋白羟基化、甲基化的调控为突破点，发展和完善相关修饰蛋白组学和代谢组学 研究平台，鉴定蛋白质修饰酶和底物，通过深入的机理研究建立代谢相关的蛋白 质翻译后修饰调控网络，最后采用结构生物学方法实现向转化医学研究提高的思 路，将项目分解为各有侧重，但又互相联系，互相促进的四个课题。其中，课题 一着重建立修饰蛋白组相关技术，系统地鉴定代谢相关蛋白质修饰酶和底物，比 较这些修饰在肿瘤发生过程中的变化；课题二通过遗传及代谢组学方法，系统鉴 定上游修饰酶及这些修饰酶对于代谢组的调控；课题三则通过选择一些关键蛋白 修饰酶和靶蛋白，剖析蛋白质修饰的功能和调控机制，建立代谢相关蛋白修饰调 控网络；课题四在上述研究课题的基础上，利用结构生物学研究技术平台，筛选 能干预蛋白质修饰的活性小分子化合物。四、年度计划年度研究内容预期目标 样本的采集、文献检索、部分仪器设备 开始收集肝癌、胃肠肿瘤以及神经胶质的购置、分析方法的建立。瘤样本，完成项目所需仪器购置； 开展乙酰化调节代谢机理的研究，重点 部分阐明2-3个代谢酶的乙酰化调控机研究乙酰化调节肿瘤相关的糖酵解和理，找出其修饰酶；第三羧酸循坏分子机理。 开始阐明代谢物调节蛋白羟基化与 甲第 进行代谢物影响羟基化及甲基化的机基化的机理；理研究。 制备可以用于亲和富集方法的抗甲 基 建立蛋白质羟基化和甲基化修饰组学化可抗羟基化抗体、建立分析方法平分析平台。台。年 选定乙酰化、去乙酰化、甲基化、羟基 获得3-5个可以表达修饰酶的载体，表化等目标蛋白，开始构建表达载体。达2-3个酶并力争获得蛋白晶体； 建立代谢物及代谢组学分析的方法。 建立内源性小分子的分析方法： 包括分析样品的制备方法、LC-MS/MS方法、NMR方法。 继续开展乙酰化调节代谢机理的研究，阐明2-3个代谢酶的乙酰化调控机理，重点研究乙酰化调节肿瘤相关的糖酵找出其修饰酶；解和三羧酸循坏分子机理的研究。 继续阐明代谢物调节蛋白羟基化的 机 继续进行代谢物影响羟基化及甲基化理，完成2-3个代谢酶乙酰化调控机理的机理研究。的研究并发表研究论文； 继续建立蛋白质羟基化和甲基化修饰 利用可以用于亲和富集方法的抗甲 基第组学分析平台。化可抗羟基化抗体、建立分析方法平 继续乙酰化、去乙酰化、甲基化、羟基台。二化等目标蛋白的表达及结晶，并开始利 获得1-2个修饰酶的初步结构获得数个用获得的数据设计并合成可影响酶活可以表达修饰酶的载体，表达2-3个酶年的小分子化合物。并力争获得蛋白晶体； 开始代谢物及代谢组学分析。 利用建立的代谢物和代谢组分析方法，开始分析乙酰化改变对代谢物和代谢组的改变。第 继续开展乙酰化调节代谢机理的研究， 初步阐明乙酰化修饰改变对糖酵解 和重点转向研究乙酰化如何协同调节肿三羧酸循环相对代谢流的调控作用，并三瘤相关的糖酵解和三羧酸循。探明此类改变在癌症发生发展中的意 继续进行代谢物影响羟基化及甲基化义；年的机理研究，阐明代谢物如何影响细胞 继续阐明代谢物调节蛋白羟基化的 机年 度研究内容预期目标信号通路，尤其是代谢物改变如何促进理，完成1-3个代谢酶乙酰化调控机理肿瘤干细胞的生成。的研究并发表研究论文； 继续建立蛋白质羟基化和甲基化修饰 探明代谢物改变促进肿瘤干细胞形成组学分析平台。的初步机理； 继续乙酰化、去乙酰化、甲基化、羟基 利用可以用于亲和富集方法的抗甲 基化等目标蛋白的表达及结晶，并开始利化可抗羟基化抗体、建立分析方法平用获得的数据设计并合成可影响酶活台。的小分子化合物。 获得1-2个修饰酶的初步结构获得数个 开始代谢物及代谢组学分析。可以表达修饰酶的载体，表达2-3个酶并力争获得蛋白晶体； 利用建立的代谢物和代谢组分析方法，开始分析乙酰化改变对代谢物和代谢组的改变。 阐明乙酰化如何协同调节肿瘤相关的 根据肿瘤细胞代谢通路乙酰化的特点，糖酵解和三羧酸循代谢通路，以肿瘤为定向调节关键酶的乙酰化水平以达到模型分析肿瘤细胞代谢的乙酰化修饰调控代谢通路相对活性的目的，实现对特质。肿瘤生长的抑制，申报1-2项发明专利； 继续进行代谢物影响羟基化及甲基化 发现系列可以回复因代谢中间物失调第的机理研究，研究如何通过小分子干预影响到小分子活性化合物，申报专利并消除代谢中间物失调带来的促肿瘤效发表研究论文；四应。 获得全细胞水平蛋白甲基化、羟基化修 用亲和富集的方法研究蛋白质羟基化饰组，为中长期研究奠定基础。年和甲基化修饰组。 获得2-3个修饰酶的小分子干预化合 用结构生物学及生物化学的的方法验物；证可影响酶活的小分子化合物。 阐明乙酰化改变对代谢组的影响以 及 继续代谢物及代谢组学分析。三羧酸循环中间物改变对细胞代谢组的影响。年 度研究内容预期目标 整理、总结乙酰化修饰调控代谢的分子 初步建立乙酰化修饰调控代谢的调控机理。网络，重点建立肿瘤相关糖酵解及三羧 总结代谢物失调影响蛋白质甲基化、羟酸循环受乙酰化协同调控网络；基化的规律。 建立代谢物调控细胞信号通路的网络 完善代谢相关的蛋白质翻译后修饰数体系，重点建立三羧酸循环代谢物对细第据库。胞信号通路的调节作用； 确立数个可用于肿瘤干预的小分子化 形成较为完整的蛋白质乙酰化、甲 基五合物。化、羟基化修饰组数据库； 课题收尾总结：对所得结果分析总结、 全面验证小分子化合物的调节修饰酶年建立相应代谢物数据库、撰写发表论作用及对肿瘤细胞的抑制效果。文、申报科研成果。 发现相关的肿瘤小分子标志物并进 一 论文整理，申请专利。步进行临床验证。 课题总结结题，书写发表国内外重要期刊论文。